Com cerca de 100 milhões de células no cérebro do rato e tamanhos de imagens de resolução celular de todo o cérebro se aproximando da escala de terabytes, ferramentas avançadas de análise de imagem são necessárias para quantificar com precisão as células. Nosso pipeline computacional pode pré-processar imagens e quantificar núcleos dentro do córtex do camundongo, mantendo um compromisso razoável entre a precisão da detecção celular, o tempo de imagem e os recursos computacionais. Demonstrando o procedimento estarão Felix Kyere e Ian Curtin, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, monte a amostra no suporte de tamanho de amostra correto de modo que a amostra seja orientada com a dimensão z não superior a 5,2 milímetros de profundidade devido à distância de trabalho nominal do microscópio UltraMicroscope II. Em seguida, insira o suporte no berço da amostra de tal forma que o parafuso do suporte esteja em ângulo de 45 graus em relação aos suportes do berço. Em seguida, coloque o berço em uma posição tal que a amostra seja orientada perpendicularmente ao caminho da luz.
Depois, defina o corpo de zoom no microscópio para ampliação de 4x ou superior, produzindo 0,75 micrômetros por pixel. No software Inspector Pro, selecione uma única folha de luz com um valor de abertura numérica de aproximadamente 0,08. Para garantir que a resolução axial seja mantida ao longo da largura da imagem, selecione Foco dinâmico horizontal e aplique o número recomendado de etapas, dependendo do comprimento de onda do laser.
Em seguida, ajuste o foco fino para cada canal em relação ao canal de registro e a potência do laser por canal em relação às propriedades do canal. Em seguida, ajuste a largura da folha de luz para cerca de 50% para garantir que a potência da folha seja distribuída de forma ideal na dimensão y para o tamanho da amostra. Depois, defina o número de blocos em relação ao tamanho da amostra com uma sobreposição recomendada de 15% entre blocos e capture imagens para cada canal sequencialmente para cada pilha em uma determinada posição de bloco.
Primeiro, baixe e instale o gerenciador de ambiente Conda para Linux e as ferramentas de processamento de imagem NuMorph. Na linha de comando, execute o matlab e NM_setup. m do NuMorph para baixar e instalar pacotes de software de análise de imagem necessários para análise.
Em seguida, especifique nomes de amostra, diretórios de entrada e saída, informações de canal e parâmetros de imagem de folha de luz editando o arquivo NM_samples.m. Para ajuste de intensidade, em NMp_template, defina intenso o ajuste para verdadeiro e use_processed_images como falso ao trabalhar com um novo conjunto de imagens. Em seguida, defina save_images e save_samples como verdadeiros.
Em seguida, defina o sombreamento de bloco como básico para aplicar a correção de sombreamento usando o algoritmo básico ou manual para aplicar a correção de sombreamento de bloco usando medições do UltraMicroscope II em larguras específicas de folha de luz. Para alinhamento do canal de imagem, em NMp_template, defina channel_alignment como true e channel alignment_method como translation ou elastics. Em seguida, defina sift_refinement como valor verdadeiro e de sobreposição de 0,15 para corresponder às sobreposições de blocos durante a geração de imagens.
Para executar etapas de pré-processamento no MATLAB, especifique o nome do exemplo e defina a configuração como NM_config exemplo de processo. Em seguida, execute qualquer uma das etapas de pré-processamento especificando NM_process ponto de configuração enquanto especifica o estágio usando intensidade, alinhamento ou ponto e verifique se há arquivos de saída no diretório de saída para cada um dos estágios. Comece com uma imagem do Atlas 3D e uma imagem de anotação associada que atribui cada voxel a uma estrutura específica.
Alinhe a imagem do Atlas e o arquivo de anotações para garantir que eles correspondam corretamente na orientação correta. Após o alinhamento, processe os arquivos no NuMorph para especificar as entradas conforme descrito no manuscrito executando o comando. Em NMa_template, defina resample_images como true e resample_resolution para corresponder ao Atlas.
Em seguida, especifique o número do canal a ser reamostrado usando resample_channels. Depois, defina register_images como true, especifique o atlas_file para corresponder ao arquivo no diretório Atlas e defina registration_parameters como padrão. Em seguida, defina save_registered_images como true.
Para detecção de núcleos, contagem de células e classificação, defina count_nuclei e classify_cells como verdadeiros. Em seguida, defina o count_method como 3dunet e min_intensity para definir um limite de intensidade mínima para objetos detectados. Em seguida, defina classify_method para qualquer limiar, que é baseado em uma intensidade de fluorescência não supervisionada em posições de centroide, ou SVM, que modela um classificador de máquina vetorial de suporte linear supervisionado.
Para executar etapas de análise no MATLAB, especifique o nome do exemplo e defina a configuração para NM_config analisar o exemplo. Em seguida, execute qualquer uma das etapas de análise especificando NM_analyze estágio de configuração enquanto especifica o estágio usando a nova amostra, registrar, contar ou classificar e verifique o diretório de saída para arquivos de saída para cada um dos estágios. Em NMe_template, defina update como true e compare_structures_by como qualquer um dos índices.
Em seguida, defina o arquivo de modelo e a tabela de estrutura que especifica todos os índices e estruturas de estrutura possíveis para avaliar ao especificar a contagem de células e a classificação de tipo de célula. A limpeza tecidual usando o protocolo iDISCO+e marcadores de núcleos específicos de camadas neuronais resultou em grupos celulares claramente definidos de neurônios de camada superior e inferior no isocórtex. A contagem de células usando NuMorph foi dependente de etapas de pré-processamento bem-sucedidas envolvendo ajuste de intensidade, alinhamento de canais e costura.
No entanto, erros nas etapas de pré-processamento podem resultar em costura inadequada, levando a alinhamento e costura inadequados e, portanto, resultar em imagens com padrão em foco e fora de foco. Para contar núcleos de regiões específicas do cérebro, as imagens costuradas serão anotadas usando o Atlas, permitindo que as anotações sejam sobrepostas às regiões do cérebro. Os centroides dos núcleos foram detectados com um modelo 3D U-Net treinado em NuMorph com cerca de 12 milhões de núcleos totais que eram TO-PRO-3-positivos no isocórtex com cerca de 2,6 milhões de núcleos cérebro-dois-positivos e 1,6 milhões de núcleos CTIP2-positivos.
Cerca de 3,7 e 2,9 milhões de núcleos totais TO-PRO-3-positivos nos gânglios da base e alocórtex hipocampal foram detectados, respectivamente. No entanto, as células cerebrais duas positivas detectadas nessas duas regiões cerebrais eram insignificantes, e apenas cerca de 1,5 em menos de um milhão de células positivas para CTIP2 foram detectadas cada uma nos gânglios da base e no alocórtex do hipocampo. Realize verificações de qualidade visual durante a aquisição para obter uma boa segmentação.
E configure corretamente o ambiente Conda para garantir que nenhum erro seja encontrado em uma análise a jusante. Além da contagem de células, esse pipeline permite a integração com outras ferramentas de segmentação que medem o tamanho e a forma das células, que podem ser comparadas entre grupos de genótipos. Com o nosso pipeline, podemos identificar como a anatomia do cérebro muda na resolução celular, levando à identificação de tipos de células e regiões cerebrais importantes para o risco de doença.
