Este protocolo permite que os pesquisadores monitorem a sobrevivência em uma base unicelular e identifiquem variáveis que predizem significativamente a morte celular ou a sobrevivência. Ensaios convencionais de citotoxicidade avaliam populações de células e não têm a capacidade de discriminar células individuais. A microscopia longitudinal permite a atribuição do tempo de morte para cada célula em uma população.
Esta técnica é adequada para avaliar novas terapias para doenças neurodegenerativas e outras condições. Este método tem se mostrado inestimável para explorar mecanismos de doença em condições neurodegenerativas, e poderia ser aplicado com igual eficácia para outros transtornos em que a morte celular é de interesse. Os pesquisadores podem ter dificuldade em alcançar eficiências de transfecção adequadas sem toxicidade indevida.
A prática com o tubo multicanal e a familiaridade com o protocolo devem diminuir essas dificuldades ao longo do tempo. Microscopia é uma metodologia inerentemente visual. Portanto, a técnica pode ser mais facilmente compreendida observando além da leitura.
Para começar, combine a quantidade apropriada de mídia séreo reduzida e reagente de transfecção em um tubo, e reduza a mídia sérico e o DNA em um tubo separado. Incuba-os em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos.
Use um tubo multicanal e calhas plásticas estéreis para lavar os neurônios corticais duas vezes com 100 microliters de mídia basal neural por poço. E armazene a mídia condicionada e outras mídias remanescentes a 37 graus Celsius. Substitua o NBM por 100 microliters de solução NBKY previamente preparada por poço.
Após 20 minutos, pipet 50 microliters do reagente transfecção e mistura de DNA dropwise em cada poço. Incubar as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Enxágüe as células duas vezes com a solução NBKY.
Em seguida, adicione 100 microliters de mídia condicionada e 100 microliters de solução NBC para os poços. Para começar a fotografar as células, coloque a placa 96 em um microscópio fluorescente. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura.
Em seguida, navegue até áreas de interesse e regissuça suas coordenadas x e y em relação à marca. Use uma marca fiduciária exclusiva de cada placa como referência para alinhamento futuro e salve uma imagem para referência futura. Finalmente, concentre-se nas células transfeinadas expressando um rótulo fluorescente.
Tire várias imagens em intervalos regularmente espaçados nos canais fluorescentes apropriados. Para começar com o processamento de imagens, clique duas vezes no ícone Fiji. Em seguida, clique e arraste a imagem sublinhando o processamento macro para a barra fiji para abrir a macro dentro de Fiji.
Ajuste as linhas de duas a sete da macro de processamento de sublinhado da imagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, clique na costura e, em seguida, costura de grade/coleta. Ajuste as configurações dentro dos menus suspensos, digite e peça, até que uma imagem com precisão seja produzida.
Ajuste as variáveis de tipo de grade e ordem de ponto nas linhas oito e nove de acordo com essas seleções. Em seguida, ajuste a linha 10 para especificar o número de imagens por poço e defina a opção de subtração de fundo na linha 14 para verdade, se necessário. Ajuste a linha 15 para definir o raio da bola rolando de acordo com o protocolo de texto e clique em Executar.
Finalmente, abra as pilhas de imagens de saída e identifique manualmente os neurônios mortos de acordo com o protocolo de texto. Registo os dados em um arquivo de planilha. Para realizar análises estatísticas, clique duas vezes no ícone para sobreviver.
R script. Destaque a linha dois e clique no botão executar para carregar a biblioteca de sobrevivência. Em seguida, altere o caminho na linha cinco para chamar a planilha de entrada e clique no botão executar.
Destaque as linhas oito e nove e clique no botão executar para realizar a análise de riscos proporcionais de Cox. Linhas de destaque 12 a 16 e 19 a 24. Clique no botão executar para traçar o risco cumulativo de morte e os dados de sobrevivência como uma curva Kaplan-Meier.
Neste estudo, os neurônios cortical de ratos foram transfectados a quatro dias após o revestimento com um plasmídeo codificando a proteína fluorescente M maçã. 24 horas após a transfecção, os neurônios foram imagens por microscopia de fluorescência a cada 24 horas por 10 dias consecutivos. Após a aquisição da imagem, as imagens foram processadas e examinadas sequencialmente para marcar a morte da célula.
A hora da morte de cada célula foi determinada por mudanças na fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular. A análise de riscos proporcionais de Cox realizada nos dados de sobrevivência dos neurônios mutantes resultou em uma razão de risco de 2,2. Este resultado indicou uma taxa mais rápida de morte nos neurônios mutantes em comparação com a população do tipo selvagem.
A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é pipetar cuidadosamente. Minimizar a exposição ao ar e evitar bolhas é fundamental para uma transfecção bem sucedida. Após a transfecção, a microscopia de fluorescência longitudinal pode ser usada para rastrear vários fatores que podem contribuir para a morte celular, incluindo localização de proteínas, rotatividade e nível de expressão, além da sobrevivência celular.
No campo da neuro degeneração, a natureza dinâmica da microscopia longitudinal lançou luz sobre se a agregação de proteínas associadas à doença representa um evento tóxico ou protetor. Nenhum desses reagentes ou instrumentos são perigosos.
