A pupilometria pode ser usada para estimar limiares complexos de reconhecimento sonoro e, combinada com outros métodos, pode ser usada para determinar os efeitos de várias formas de perda auditiva nesses limiares. Esta técnica pode ser usada para caracterizar dados da mesma modalidade de seres humanos e de animais não treinados. É relativamente fácil de configurar e minimamente invasivo.
Medidas de comportamento e percepção são difíceis de obter em modelos animais de perda auditiva. Este método é uma maneira de quantificar comportamentos complexos de reconhecimento sonoro em animais. Como fazemos todos os experimentos comportamentais com animais, a paciência é a chave.
Aproveite o tempo para acostumar o animal à configuração experimental. Mantenha as sessões experimentais curtas e monitore o animal de perto. Para começar, monte um alto-falante calibrado na parede da câmara atenuada de som a uma altura igual à posição em que o animal será colocado.
Para a entrega de estímulos de campo livre, coloque o animal no recinto garantindo que grandes movimentos corporais não sejam possíveis e fixe a cabeça do animal na estrutura rígida. Coloque um sensor piezoelétrico sob o gabinete para detectar e registrar os movimentos dos animais. Em seguida, posicione a câmera de imagem da pupila a uma distância de 25 centímetros do olho do sujeito.
Para configurar o sopro de ar, use um suporte preso à mesa para colocar uma ponta de pipeta a cerca de 15 centímetros na frente do focinho do animal. Conecte um tubo de silicone de cerca de três milímetros de diâmetro à ponta da pipeta e conecte o tubo a um cilindro de ar regulado. Mantenha a pressão de ar do cilindro entre 20 e 25 psi.
E passe o tubo através de uma válvula de pinça para controlar o tempo e a duração do sopro de ar, usando um relé controlado por computador. Ilumine o olho com uma matriz de LED infravermelho colocada a cerca de 10 centímetros de distância. Use iluminação LED branca a uma intensidade de cerca de 2000 candelas por metro quadrado para iluminar o olho fotografado e trazer o diâmetro da pupila basal para cerca de 3,5 milímetros.
Abra o software de aquisição da pupila e adquira o vídeo da pupila usando uma câmera com uma lente de 16 milímetros com uma resolução espacial de um ângulo visual de 0,15 graus e um filtro infravermelho colocado a uma distância de 25 centímetros do olho fotografado. Certifique-se de que o olho está centrado na área da imagem. Regule a abertura e o foco da câmera, bem como o nível de infravermelho, até que o contorno da pupila fotografada esteja em foco nítido.
No software de aquisição da pupila, defina a área de interesse que contém a pupila selecionando uma área retangular com o mouse. Em seguida, use o painel de controles para ajustar o brilho e o contraste do vídeo adquirido. Defina a densidade de varredura como cinco e ajuste o limite de modo que o ajuste da elipse corresponda de perto ao contorno da pupila no vídeo.
Usando o software do processador de interface neural, adquira e salve o sinal analógico do diâmetro da pupila ou traço PD, o traço de tensão do movimento de gravação do sensor piezoelétrico, os tempos de entrega do estímulo e os tempos de entrega do sopro de ar. Selecione oito exemplos diferentes de vocalizações de cobaias de comprimentos semelhantes de duas categorias diferentes de vocalizações. Por exemplo, chamadas wheek e chamadas de lamentação.
Uma categoria servirá como estímulo padrão e a outra categoria servirá como estímulos excêntricos ou desviantes. Para gerar um segundo de estímulos padrão e desviantes de comprimento embutidos no ruído em diferentes níveis de relação sinal-ruído ou SNR, adicione ruído branco de igual comprimento às chamadas. A gama de SNRs amostrados neste experimento está entre menos 24 e mais 40 decibéis.
Para cada sessão, prepare uma sequência de apresentação de estímulos pseudoaleatórios que contenha estímulos padrão superiores a 90% do tempo. Certifique-se de que entre estímulos desviantes haja pelo menos 20 a 40 tentativas com estímulos padrão. Use uma intensidade de estímulo fixa para todas as apresentações de estímulo.
Apresente os estímulos com alta regularidade temporal. Para manter o envolvimento do animal com os estímulos e minimizar a habituação, opcionalmente dê um breve sopro de ar após o estímulo desviante. Certifique-se de que o início do sopro de ar esteja suficientemente separado da duração do estímulo para que o estímulo evoque as respostas de dilatação da pupila.
Alcance um pico antes que os artefatos de piscar induzidos por sopro de ar. Execute o código pupil_avg_JOVE_m e selecione o arquivo de dados de uma única sessão na caixa de diálogo pop-up para executar a detecção de movimento e a exclusão de avaliação para cada sessão. Em seguida, execute o mesmo código e selecione todos os arquivos de dados a serem analisados na caixa de diálogo pop-up.
Para remover artefatos de piscar os olhos, pré-processe os dados e obtenha a dilatação média da pupila para cada estímulo nas sessões. A média das mudanças no diâmetro da pupila evocado pelo estímulo para cada condição de estímulo em todas as sessões dentro de cada animal e, em seguida, entre os animais para gerar a resposta média de dilatação da pupila a cada condição de estímulo. Concatena verticalmente todas as saídas do código pupil_avg_JOVE.
m ou todas as sessões animais, SNRs e atenuações para construir uma matriz contendo as colunas, identificação animal, SNR, nível sonoro e valores de diâmetro da pupila. Para cada SNR, plote os pesos correspondentes ao intercepto para visualizar os resultados. Faça o mesmo para termos lineares e quadráticos.
Coloque toda a porcentagem de sessões sábias de ensaios com mudanças significativas na pupila em cada célula de uma matriz de células, onde as células são organizadas de SNR inferior para superior. Usando o código pupil_threshold_estimate_JOVE_m, estime o limite de categorização de chamada no ruído. As respostas médias dos alunos de três animais são mostradas nesta figura.
As respostas médias das pupilas aos estímulos padrão do lamento são representadas pela linha azul e o sombreamento corresponde a mais menos um erro padrão de média. Linhas de cinza e sombreamento correspondem à média e mais menos um erro padrão de média das respostas pupilares evocadas por estímulos desviantes wheek. A intensidade do sombreamento cinza corresponde ao SNR.
A linha verde e o sombreamento correspondem ao traço médio da pupila no limiar SNR. A linha vertical vermelha corresponde ao início do estímulo. A linha vertical laranja corresponde ao início do sopro de ar e as linhas tracejadas azul-petróleo correspondem à janela da ACG.
A função psicométrica ajustada à porcentagem de ensaios com alterações significativas do diâmetro da pupila provocadas pelo estímulo desviante em função do SNR é mostrada nesta figura. Bigodes correspondem a mais menos um erro padrão de média. Note-se que 50% do máximo é atingido a cerca de menos 20 decibéis SNR.
Pelos dados adquiridos de alta qualidade, é importante aclimatar bem o animal à configuração experimental e manter condições constantes de eliminação. Mantenha a sessão de experimento curta para minimizar a habitação do animal aos estímulos desviantes. O EEG, ou registros eletrofisiológicos combinados com pupilometria, gerariam informações adicionais sobre os déficits neurais, déficits subjacentes de categorização de chamada em ruído em animais com deficiência auditiva.
