Nosso protocolo permite que os usuários meçam a atividade de ALDH1A1, um biomarcador de células-tronco usando diversas modalidades que vão desde citometria de fluxo até imagens moleculares de células vivas. As principais vantagens dessa abordagem são que a ativação da sonda envolve a resposta de turnaround caracterizada por uma alta relação sinal/fundo, bem como a detecção seletiva da isoforma ALDH1A1. Demonstrando esse procedimento estarão Michael Lee, Sarah Gardner e Rodrigo Tapia Hernandez, alunos de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, aspirar o meio de crescimento das células cultivadas de interesse em lâmina de oito poços. Adicionar 500 microlitros por poço de meio livre de soro suplementado com uma sonda fluorogênica seletiva de isoforma dois micromolares ou uma sonda de controle não reativa. Incubar a lâmina à temperatura ambiente durante 30 minutos.
Após a incubação, proceda imediatamente à imagem do microscópio confocal. Localize as células com ampliação de 10 vezes. O canal FITC e os canais de luz transmitida são necessários para este experimento.
Localize e focalize as células usando o canal de luz transmitido para focar no mesmo plano Z durante todo o experimento para remover o viés. Ajuste a potência do laser e o ganho de FITC para a configuração apropriada onde o sinal das amostras de controle AlDeSense AM é minimamente detectável, enquanto ainda vê o sinal nas amostras AlDeSense AM. Ajuste cada parâmetro deslizando a barra correspondente.
As configurações podem ter que ser ajustadas algumas vezes para identificar os parâmetros corretos. Uma vez otimizado, complete o resto do experimento dentro dessa linhagem celular usando parâmetros idênticos. Tire três imagens por poço para um total de três poços por condição de tratamento e salve as imagens.
Certifique-se de focar usando o canal de luz transmitido apenas enquanto alterna entre planos e poços para evitar viés. Em seguida, usando o software de processamento de imagem, dividir o arquivo CZI em diferentes canais e contar o número total de células e células fluorescentes. Para determinar a porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase 1A1, divida o número de células fluorescentes pelo número total de células em cada imagem.
Conte da mesma maneira para cada imagem para evitar variáveis de confusão. Retirar um frasco de cultura de células T25 contendo as células mantidas na incubadora. Adicione tripsina para descolamento de células e conte as células usando um contador de células automatizado.
Em seguida, coloque as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros por centrifugação a 180G por cinco minutos a 25 graus Celsius. Ressuspender as células em um mililitro de uma sonda de dois micromolares ou solução de sonda de controle em PBS. Balançar as células à temperatura ambiente por 60 minutos para garantir uma exposição uniforme ao corante.
Após o período de incubação, peletizar as células por centrifugação a 180 G por cinco minutos a 25 graus Celsius. Em seguida, ressuspenda as células em 0,5 mililitros de PBS. Passe as células através de um filtro de células de malha de nylon de 35 micrômetros em um tubo colocado no gelo para remover aglomerados celulares que podem obstruir o citômetro de fluxo.
Ligue o instrumento de citômetro de fluxo e execute o protocolo de inicialização. Verifique se há líquido na bainha e cintura vazia. Execute as linhas com 10% de água sanitária e água por cinco minutos cada.
Em seguida, execute contas de controle de qualidade para garantir o funcionamento adequado. Na guia configurações, selecione dispersão lateral de dispersão direta e FITC para o filtro de fluorescência. Desenhe uma área de dispersão para frente versus um gráfico de área de dispersão lateral para a população de células principais perto do centro do gráfico.
Em seguida, desenhe uma área de dispersão para a frente, versus um gráfico de largura de dispersão para a frente para as faixas horizontais estreitas que indicam singlets. Em seguida, desenhe uma área FITC versus um gráfico de área de dispersão para frente para observar a distribuição das células ordenadas pela sonda de giro fluorogênico seletivo de isoforma. Em seguida, desenhe um histograma da área do FITC para observar o deslocamento na população com base no FITC e determinar a porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase 1A1.
Para otimizar a potência do laser FITC, execute uma amostra com a sonda de modo que a cauda direita da curva do histograma esteja próxima do sinal máximo da área FITC. A etapa de otimização da potência do laser pode ter que ser repetida várias vezes, mas a potência do laser não deve ser alterada em todas as amostras, uma vez que uma configuração tenha sido designada para um experimento. Posteriormente, adicione uma amostra à peneira e execute-a com a sonda de controle.
Um deslocamento populacional deve ser observável para revelar a faixa dinâmica máxima. Execute cada amostra para 10.000 contagens feitas em triplicata. Após a conclusão da coleta da amostra, executar as linhas com água sanitária a 10% por cinco minutos cada, em seguida, desligar o instrumento.
Processar os dados usando um software de citometria de fluxo e percorrer a população celular desejada. Usando a seleção da porta retangular, ajuste a marcha negativa para aldeído desidrogenase 1A1, de modo que mais de 99,5% dos eventos nas amostras da sonda controle ocorram dentro dessa comporta. As demais células serão consideradas positivas para aldeído desidrogenase 1A1.
Aplique as mesmas portas à amostra da sonda. Quantificar o número de eventos considerados aldeído desidrogenase 1A1 negativo e 1A1 positivo. As dobras médias de turn-ons para cada linhagem celular foram determinadas para quantificar a atividade total da aldeído desidrogenase 1A1.
A porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase 1A1 foi determinada em cada linhagem celular por ajuste da potência e ganho do laser. Para minimizar o sinal na amostra tratada com AlDeSense AM o sinal de fluorescência foi otimizado nas células tratadas com AlDeSense AM. Pela contagem do número de células positivas para aldeído desidrogenase A1A, determinou-se a porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase A1A.
Com a aplicação da sonda fluorogênica seletiva de isoformas, a população celular positiva para aldeído desidrogenase 1A1 foi quantificada dentro de cada linhagem celular por meio de gating para os 0,5% superiores das células mais brilhantes dentro da população controle tratada com AlDeSense AM. A análise do painel de células de câncer de ovário revelou a porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase 1A1. A partir dos resultados obtidos das linhagens de células cancerosas testadas, pode-se concluir que BG-1 tem a menor atividade de aldeído desidrogenase 1A1 e menor população positiva para aldeído desidrogenase 1A1.
Adicionalmente, imagens confocais e citometria de fluxo revelaram a maior porcentagem de células positivas para aldeído desidrogenase 1A1 em células Caov-3. Mas a atividade geral da linhagem celular foi apenas a terceira mais alta. Alternativamente, as células OVCAR-3 continham a terceira maior população positiva para aldeído desidrogenase 1A1, mas exibiram a maior atividade global.
AlDeSense é uma sonda versátil e generalizável para identificar CSCs em linhagens celulares imortalizadas e em amostras de pacientes. Esperamos vê-la como uma ferramenta prognóstica no cenário clínico.
