Nosso protocolo apresenta um método altamente eficiente e facilmente reprodutível para quantificar o DNA de fita simples, que é um marcador de estresse de replicação em uma variedade de linhagens celulares. Além disso, sua simplicidade permite aplicativos e telas de alta taxa de transferência. Em particular, este método permite a rápida quantificação de um estresse de replicação, uma característica de vários cânceres de ovário.
Também é passível de um software de análise automática de host, aumentando ainda mais a eficiência. O DNA de fita simples está agora sendo ativamente considerado como um biomarcador para resposta à quimioterapia visando as vias de reparo do DNA. Portanto, esse método é altamente aplicável nesse cenário.
O estresse de replicação existe além dos contextos de câncer de ovário ou cânceres deficientes em BRCA1, BRCA2. E assim, este método pode ser aplicado a uma ampla gama de outros tipos de células ou contextos de doenças. Para começar, faça deslizamentos de cobertura revestidos de polilisina adicionando deslizamentos de cobertura autoclavados de 12 milímetros de diâmetro e solução de polilisina a um tubo cônico de 50 mililitros e coloque em um balancim por 15 minutos.
Aspirar a solução em um exaustor de cultura de tecidos. Lave as folhas da tampa adicionando água estéril e coloque o tubo que contém a tampa desliza de volta no balancim por cinco minutos. Depois de lavar a tampa desliza três vezes, aspirar a água do tubo e espalhe os deslizamentos da tampa em um prato estéril.
Aspirar a água restante e deixá-los secar no capuz de cultura de tecidos por uma hora ou até que não restem gotículas de água. Uma vez seco, sele o prato com Parafilme e coloque-o a 4 graus Celsius. Para evitar que o desprendimento das células da tampa deslize durante a etapa de pré-extração, coloque uma folha de cobertura revestida de polilisina em cada poço de uma placa de 24 poços.
Quando as células OVCAR3 atingirem 70 a 80% de confluência, aspirar o meio da placa e lavar as células com 5 a 7 mililitros de PBS. Aspirar o PBS da placa. Depois de aspirar o PBS, adicione 1 mililitro de tripsina a 0,25% e coloque o prato na incubadora a 37 graus Celsius por 8 a 10 minutos ou até que as células se levantem do fundo da placa.
Recolher as células com 5 a 10 mililitros de meio e adicionar a suspensão celular a um tubo cónico. Conte as células manualmente com um hemocitômetro usando procedimentos padrão. Em seguida, dilua a suspensão celular e obtenha um número que produza de 70 a 80% de confluência após três populações.
Adicione 1 mililitro de suspensão celular em lâminas de cobertura de polilisina colocadas nos poços de uma placa de 24 poços e cultive as células no meio de cultura em condições padrão. Após uma duplicação populacional, aspirar o meio existente da placa e pulsar as células com 10 IdU micromolares para as duas duplicações populacionais subsequentes. Para colher as células, substitua o meio por 0,5% PBSTx gelado no gelo por cinco minutos.
Para fixação das células, aspirar PBSTx e incubar as células por 15 minutos com paraformaldeído a 3% à temperatura ambiente. Após três a quatro lavagens com PBS, mantenha as células fixas a 4 graus Celsius até novo uso. Após a fixação, permeabilizar as células utilizando 0,5%PBSTx sobre gelo por cinco minutos, garantindo cobrir todo o deslizamento da cobertura.
Após lavar as células três a quatro vezes com 1 mililitro de 0,2%PBST à temperatura ambiente, aspirar o PBST e bloquear as amostras utilizando 5%BSA feito em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Para a imunocoloração, prepare uma câmara unificada colocando uma toalha de papel molhada em um Tupperware de fundo plano. Cubra a tampa da placa de 24 poços com Parafilme.
Coloque-o na câmara umidificado e coloque as folhas de tampa na tampa da placa. Adicione 60 microlitros de anticorpo primário anti-BrdU diluído do rato na parte superior do deslizamento da tampa. Alternativamente, para reduzir o anticorpo da secagem e usar menos volume, coloque uma gota de anticorpo diluído no parafilme e vire a tampa sobre ele.
Em seguida, incube por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspirar o anticorpo primário. Devolva as tampas de volta para uma placa de 24 poços e lave-as com 0,2% PBST quatro vezes.
Adicione o anticorpo secundário diluído no deslizamento da tampa, como demonstrado anteriormente, e incube por uma hora no escuro à temperatura ambiente. Rotule uma lâmina de microscópio e monte a folha de tampa nas lâminas com o meio de montagem DAPI. Armazene as lâminas no escuro à temperatura ambiente por 24 horas se o meio de montagem precisar ser curado ou endurecido.
Os núcleos derivados das células não tratadas e tratadas com hidroxiureia 0,5 milimolar foram corados e identificáveis nos canais DAPI e IdU. A análise dessas imagens consiste em quantificar o número de focos em cada núcleo. O número de focos é proporcional ao grau de estresse de replicação.
É importante considerar o tempo de duplicação da linhagem celular de escolha, pois o tempo de pulsação da IdU pode variar por períodos de duplicação mais longos ou mais curtos. Alternativamente, podemos sondar as células em busca da proteína de replicação A para confirmar os resultados e avaliar várias respostas ao estresse de replicação nas células. Esta técnica é usada para muitas linhagens celulares em conjunto com qualquer agente indutor de danos ao DNA para examinar o acúmulo de DNA de tensão única.
Assim, este método é amplamente acessível e aplicável.
