Este protocolo descreve o implante ortotópico de células cancerosas derivadas do paciente na parede do ceco de camundongos imunodeficientes. Esse modelo recapitula a doença metastática avançada do câncer colorretal. O modelo de câncer colorretal ortotópico aqui apresentado recapitula o cenário clínico de tumores intestinais avançados e doença metastática em pacientes com câncer colorretal que não podem ser estudados usando organoides derivados do paciente ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente.
De um camundongo eutanasiado, extraia o tumor removendo-o cuidadosamente da pele e do tecido não tumoral circundante usando tesoura e pinça. Coloque os tumores colhidos em PBS a quatro graus Celsius. Usando uma lâmina, dissociar os tumores em uma placa de cultura de 10 centímetros contendo um milímetro de meio.
Coloque a amostra dissociada homogênea em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione o meio a um volume final de cinco mililitros. Em seguida, adicione o meio de digestão ao tubo.
Coloque o tubo em uma posição de 45 graus dentro de uma incubadora de cultura celular por uma hora a 37 graus Celsius. Durante a incubação de uma hora, misture a solução a cada 15 minutos com uma pipeta de cinco mililitros. Após a incubação, adicione cinco mililitros de meio e misture bem.
Em seguida, classifique a solução com um filtro de células de 100 micrômetros usando um tubo estéril de 50 mililitros. Centrifugar as células separadas a 500g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em três mililitros de solução tampão de lise 1x hemácias.
Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione três mililitros de meio e misture a amostra. Centrifugar a 500g por 10 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet com cinco a 10 mililitros de meio e use um contador de células para calcular o número total de células. Após centrifugar as células a 500g por 10 minutos à temperatura ambiente, ressuspender em 10 mililitros de PBS. Repita a centrifugação e lave com 10 mililitros de PBS.
Ressuspender o pellet para obter uma concentração de 20 vezes 10 a seis células por mililitro e misturar bem para obter uma suspensão celular homogênea. Em seguida, prepare uma seringa de 29g para injeção de ceco. Coloque 50 microlitros da suspensão de células tumorais na seringa e certifique-se de que não restam bolhas de ar na seringa.
Coloque a seringa sobre o gelo. Primeiro, esterilize o local cirúrgico pulverizando com detergente desinfetante e limpando. Em seguida, depilar o abdômen usando uma máquina de depilação de camundongo.
Coloque o rato em posição supina e desinfete o abdómen esfregando com clorexidina ou iodopovidona. Faça uma incisão longitudinal de um centímetro sobre o abdome inferior usando uma tesoura cirúrgica. Separe cuidadosamente a pele para os lados para expor o peritônio.
Em seguida, fazer uma incisão de 0,5 a um centímetro na membrana do peritônio, suficiente para exteriorizar o ceco. Usando uma gaze estéril pré-cortada, isole cuidadosamente o ceco do rato. Umedecer o ceco foi soro fisiológico durante todo o procedimento.
Imobilize o ceco segurando-o cuidadosamente com pinça e, em seguida, introduza a agulha superficialmente na parede do ceco. Lentamente, injetar todo o volume de 50 microlitros de suspensão de células tumorais. Esse processo leva em torno de 10 segundos.
Após a injeção, remova lentamente a agulha do ceco e aplique uma pressão suave no local da injeção com um aplicador de ponta de algodão. Limpe o ceco com solução salina para remover quaisquer detritos e devolver o ceco de volta ao abdômen do animal. Fechar o peritônio com pontos 5/0 e, em seguida, fechar a pele do abdome com pontos 5/0.
Tumores ortotópicos CRC-PDX foram observados no intestino de camundongos implantados com células cancerosas derivadas do paciente. A análise histológica pela coloração de hematoxilina e eosina no ceco mostrou a presença de células tumorais. A análise histológica também revelou metástases pulmonares e hepáticas nos camundongos implantados.
Camundongos portadores de tumores ortotópicos foram tratados com o veículo, droga de teste, ou com o medicamento quimioterápico irinotecano. A análise das imagens de microtomografia mostrou que, em comparação com o veículo, a droga de teste induziu uma redução do volume tumoral, que foi ainda mais reduzido em combinação com o tratamento com irinotecano. Este modelo ajudará a estudar a biologia da metástase em tumores de câncer colorretal.
