A importância do protocolo reside na sua conveniência no curto tempo necessário para sua conclusão. Isso permite um alto rendimento, uma alta concentração e um alto grau de isolamento dos tricomas caulinares e sésseis. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade.
Durante essa técnica, deve-se considerar a densidade dos tricomas da fonte vegetal e inspecionar o grau de isolamento a cada passo via microscópio durante a realização do protocolo pela primeira vez. Quem demonstrará essa técnica será Nurit Shalev, especialista em cannabis do Volcani Center. Comece esmagando um bloco de gelo seco em pequenos flocos finos usando um martelo e um objeto duro e plano em um recipiente de plástico de cinco litros.
Use um coador grande e peneire os flocos de gelo seco fino do gelo seco não triturado em outro recipiente de plástico de cinco litros. Despeje aproximadamente 200 centímetros cúbicos dos flocos de gelo seco em um copo de vidro vertical de um litro. Adicione até 10 gramas de inflorescências congeladas de cannabis sativa na primeira camada de gelo seco triturado e cubra com uma camada adicional de 200 centímetros cúbicos de gelo seco finamente esmagado.
Em seguida, cubra a abertura do copo de vidro de um litro com duas a três camadas de uma tela de um milímetro e prenda-o com elásticos. Em seguida, despeje nitrogênio líquido em um grande recipiente de aço inoxidável de fundo redondo. Insira uma malha de 350 micrômetros em uma peneira de farinha ou peneira para cobrir a malha de peneira de farinha por baixo.
Coloque esta peneira de farinha acima do grande recipiente de aço inoxidável de fundo redondo cheio de nitrogênio líquido. Para minimizar a perda da massa peneirada, certifique-se de que a largura do recipiente exceda a da peneira de farinha. Separe os tricomas do material vegetal agitando o copo de um litro com sua abertura apontando para baixo em direção à peneira de farinha.
Separe o copo a cada dois ou três minutos, permitindo a peneiração do gelo seco triturado e do material vegetal acumulado na peneira de farinha. Peneire a peneira de farinha horizontalmente para facilitar a passagem do material vegetal para o nitrogênio líquido no recipiente de aço inoxidável de fundo redondo colocado abaixo. Em seguida, adicione nitrogênio líquido ao recipiente de aço inoxidável e o gelo seco triturado ao copo de vidro de um litro quando seus níveis baixarem.
Quando o material vegetal na peneira de farinha estiver esgotado, encha novamente o material vegetal usado no copo de vidro com mais 10 gramas de material vegetal fresco e repita o processo de peneiramento até a coleta de uma quantidade suficiente de tricomas enriquecidos no recipiente. Verifique a presença de uma substância branca semelhante a um pó no fundo do recipiente de aço inoxidável submersa em nitrogênio líquido antes de uma observação ao microscópio para confirmar a coleta de tricomas suficientes. Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido a um recipiente de aço inoxidável limpo e pequeno de fundo redondo.
Em seguida, dobre uma microspeneira de 40 por 40 centímetros com uma malha de 150 micrômetros duas vezes para obter uma dobra de 20 por 20 centímetros e abra-a em forma de cone. Fixe o cone de malha na borda do recipiente de aço inoxidável de fundo redondo com um ou dois varais para que a parte aberta do cone fique ereta e sua parte pontiaguda esteja parcialmente submersa em nitrogênio líquido. Uma vez feito, despeje suavemente o nitrogênio líquido contendo a substância branca semelhante a pó obtida anteriormente no cone de micropeneira.
Usando uma escova larga, reúna e transfira qualquer material vegetal restante do primeiro recipiente para o cone de malha de 150 micrômetros. Em seguida, retire cuidadosamente o varal da tampa do recipiente e abra o cone de micropeneira para localizar os tricomas no meio da micropeneira aberta. Mantenha os quatro cantos da micropeneira juntos e submerja a parte do meio que contém os tricomas em nitrogênio líquido.
Mergulhe suavemente e agite a micropeneira no nitrogênio líquido por um minuto. Usando uma agulha estéril, faça pequenos orifícios na tampa de um tubo de ensaio de 50 mililitros para evitar o aumento da pressão. Coloque os restos vegetais não peneirados, gelo seco e tricomas maiores envolvidos no centro da micropeneira em um tubo de ensaio de 50 mililitros e armazene-o a menos 80 graus Celsius para uso futuro.
Transferir os tricomas peneirados submersos no nitrogênio líquido sequencialmente através de micropeneiras, tendo tamanhos de fluidez decrescentes de 105 a 80 a 65 e, em seguida, para 50 micrômetros. Após cada transferência, coletar separadamente os tricomas de diferentes tamanhos remanescentes na micropeneira e rotulá-los. Faça pequenos orifícios na tampa do tubo usando uma agulha estéril.
Transfira os tricomas desejados submersos em nitrogênio líquido e envolvidos na microssileira de 50 micrômetros para uma placa limpa usando uma colher pré-resfriada. Em seguida, transfira rapidamente os tricomas em pó para um tubo de 1,5 mililitro pré-resfriado rotulado usando uma espátula pré-resfriada e armazene imediatamente os tubos a 80 graus Celsius negativos para estudos adicionais. Na etapa inicial do processo de isolamento, predominaram pedaços de tecido foliar na porção isolada, em contraste com o produto final do isolamento, que foi composto inteiramente por tricomas isolados não contaminados.
A qualidade dos tricomas capitatos granulares isolados e sésseis foi observada na etapa final de isolamento. A pureza dos tricomas isolados por esse método foi comparável a um protocolo convencional. A delicada estrutura da cabeça do tricoma foi mantida, e todas as cabeças do tricoma caule isolado eram visíveis, em contraste com o método tradicional, onde a estrutura completa da cabeça do tricoma estava ausente e apenas as células discais estavam presentes.
A extração de RNA e a estimativa da integridade do RNA dos tricomas isolados indicaram alto número de integridade de RNA ou valores de RIN de 9,4 a 10, e a cromatografia em gel indicou alta integridade de RNA. Execute cuidadosamente o movimento de infusão em forma de saco T do isolamento micromicropeneirado de 150 a 50 microssímetros. Este método pode fornecer informações sobre a composição transcriptômica e provavelmente proteômica de tricomas de cannabis e tricomas de outras espécies de plantas.
Após esse procedimento, caracterizações metabólicas e transcriptômicas podem ser realizadas. Esses métodos adicionais podem ajudar a entender os níveis de expressão dos genes nos tricomas isolados e seus perfis metabólicos. Esta técnica permitiu a caracterização transcriptômica de tricomas glandulares de diferentes variedades de cannabis.
