Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation EUA concede # MCB-0741914 e 0843627-MCB; apoio de infra-estrutura adicional foi fornecida no City College de Nova York pelo National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos. Agradecemos o JKC Rose grupo no Departamento de Biologia Vegetal da Universidade de Cornell para a prestação de M82 (tipo selvagem) e CM15 (mutante) cutículas de tomate. Agradecemos ao Dr. Spyros Monastiriotis do grupo CCNY Engenharia Química do Prof Alexander Couzis por sua generosa ajuda com os experimentos de AFM. Agradecemos a Sra. Lauren Gohara de apoio design gráfico.

1. Isolamento enzimática de Tomate cutículas 5 <ol><li> Coloque os tomates vários comerciais ou cultivadas em uma tigela. Descasque a pele dos frutos em grandes seções; descartar o pericarpo interior. Lave as peles de tomate com água desionizada e conservá-los sob água numa proveta. </li><li> Prepara-se uma 50 mM, pH 4,0 tampão de acetato de sódio (a 31 ° C), colocando 1,22 g de trihidrato de acetato de sódio (M r. 136,08 g / mol) e 2,34 ml de ácido glacial acético (17,485 M) num copo, adicionando 200 ml de água desionizada, e, em seguida, ajustando o pH para 4,0 a 31 ° C. Prepara-se uma mistura contendo 4 ml de pectinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1, TCI America), 0,2 g de celulase (CE 232.734.4; 1,3 unidades / mg de sólido, Sigma Aldrich), e 13 mg de NaN3, e, em seguida adicionar 196 ml de tampão acetato de sódio à mistura de enzima para obter 200 ml da enzima cocktail final. 5 mergulhar completamente a pele de tomate desenrolada do coquetel enzima e incubara 31 ° C durante 24 horas com agitação constante (G24 Ambiental Shaker; New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Colete as peles de tomate usando um coador de cozinha ou funil Büchner e lavá-los com água deionizada. Depois disso, colocá-los numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante uma hora. Preservar as peles de tomate seco em uma garrafa rotulada e tampado para procedimentos desparafinagem subseqüentes. </li></ol> 2. Desparafinação exaustiva por Soxhlet de extração 6 <ol><li> O equipamento utilizado para desparafinação exaustiva consiste de uma fonte de calor (aquecimento manto e Variac controlador), balão de fundo redondo para um reservatório de solvente, extractor de Soxhlet, de vidro sinterizado dedal ou cartucho de extracção descartável, anti-ebulição fichas e um condensador (ver fig. 1). Note-se que o braço de sifão estreito (partes 6 e 7 na fig. 1) é muito delicado e propensos à ruptura, requerendo tratamento cuidadoso. </li><li> Coloque 0,5-1 g de pele de tomate (obtido nopasso 1.) em um almofariz, e moer a amostra para um pó grosso com um pilão, a menos que as amostras são para ser usado para medições de AFM (Secção 5). Encher um dedal de vidro sinterizado ou descartáveis ​​aproximadamente a meio caminho com a amostra e usar uma pinça para colocá-lo cuidadosamente na base da coluna de extracção. </li><li> Fixe o condensador e envolvê-la com papel alumínio. Aquecer o solvente metanol (ACS grau), na presença de alguns anti-ebulição fichas até ferver suavemente e refluxos nas paredes do balão. Cobrir o reservatório de solvente com ambos lã de vidro e uma folha de alumínio. Verificar o processo durante uma hora, ajustando a tensão Variac de modo que o reservatório se acumula sobre uma gota por segundo e sifonagem ocorre dentro do aparelho de Soxhlet, quando o dedal está cheio. </li><li> Continuar o processo de extracção durante 12 h, em seguida, baixar a manta de aquecimento e permitir que o aparelho para arrefecer. Remover o extractor e reservatório como uma única unidade de dispor de um solvente. Use tweezers para elevar o dedal para um pouco abaixo do gargalo da coluna de extracção, escorrer o excesso de solvente a partir dele, e colocar o dedal sobre uma superfície limpa. Inclinar a coluna de extracção para permitir sifão para o balão abaixo. Desconecte o frasco e despeje os resíduos em um recipiente de resíduos rotulados solvente. </li><li> Repetir os passos 2.3 e 2.4 para os solventes sucessivas de polaridade progressivamente decrescente, por exemplo, clorofórmio e hexano durante 12 h em cada caso. </li><li> Deixar a amostra cutina tomate para secar no interior do dedal, quer por sopro uma corrente de azoto gasoso sobre ele ou colocando-o num forno de vácuo à temperatura ambiente. Finalmente, a medição da massa da amostra seca e armazená-la à temperatura ambiente em um frasco com tampa selada com parafilme. </li></ol> 3. Isolamento seletivo de ceras epicuticulares e Intracuticular 3,4 <ol><li> Em primeiro lugar, lavar tomates inteiros (um lote separado de tomate daqueles descritos na 1.) Com água destilada. Seque-os com paptoalhas er e Kimwipes, e coloque-tronco para baixo sobre um pedaço de papel alumínio. </li><li> Pintar os tomates inteiros com 120% (w / w, a razão de massa) de solução aquosa de goma arábica em uma forma de cima para baixo e permitir que cerca de uma hora para a goma arábica para secar sobre a pele do fruto, deixando uma película fina. Retire-a usando uma pinça, tomando cuidado para não perfurar a pele do tomate. Repita o procedimento mais uma vez. </li><li> Adicionar os filmes para frascos contendo 1:1 (v / v) de clorofórmio-água e misturar durante três minutos. Após agitação vigorosa e separação de fases, pipetar as frações clorofórmio e evaporar-los em frascos separados descobertos, deixando de cera epicuticular. Os tomates permanecerá fisicamente intacto. Mergulhar-los em clorofórmio, durante dois minutos à temperatura ambiente e recolher a cera intracuticular após evaporação do solvente. Agora, descascar os tomates e tratá-los enzimaticamente (com celulase e pectinase em tampão acetato de sódio) para remover celulose e pectina, respectivamente (tal como descrito no <strong&gt; 1). </li><li> Se desejado, realizar desparafinação exaustiva sobre estas cutículas enzimaticamente isolado por extracção de Soxhlet (ver passo 2), utilizando três solventes de polaridade variável (metanol, clorofórmio e hexano, respectivamente). </li></ol> 4. Caracterização Molecular da cutina frutos de tomate por polarização cruzada Magia ângulo de giro de estado sólido de Ressonância Magnética Nuclear (CPMAS SSNMR) 6 <ol><li> Coloque 4-6 mg de cutículas de tomate totalmente desparafinados (cutins) em 1,6 milímetros fastMAS zirconia rotor usando o fornecido pelo fornecedor de ferramentas de embalagem. (Ou terra cutículas tomate desparafinados ou peças muito pequenas de cutículas parcialmente desparafinados são adequados.) Certifique-se que a amostra é embalado de forma uniforme, mas não com muita força, no rotor. Depois de colocar a tampa de topo, pintar metade da tampa com uma caneta marcadora negro-de tinta para facilitar medições da velocidade de rotação. </li><li> Ajustar o calços do espectrómetro de RMN para a largura de linha espectral mínimo a meia-altura-umnd calibrar o protão (1 H) e de carbono (13 C) 90 ° larguras de pulso utilizando um composto padrão, tais como adamantano. </li><li> Usando glicina ou glutamina como compostos modelo, obter intensidade máxima do sinal através da otimização de todos os parâmetros (Hartmann-Hahn níveis de energia correspondentes, 1 H-13 C tempo de contato, heteronuclear 1 H força dissociação) dos polarização cruzada magia do ângulo de rotação (CPMAS) experimento. Para os espectros adquirido com uma frequência de 1 H 600 MHz, as condições recomendadas incluem 10 kHz ou 15 kHz frequência fiação, um atraso de 3-sec entre as aquisições, e protão heteronuclear SPINAL dissociação 7 a uma intensidade de campo magnético equivalente a uma frequência de 185 kHz. </li><li> Insira o rotor cutina-embalados na sonda. Em seguida, coloque a sonda no ímã. Aumente a velocidade de centrifugação até 10 kHz gradualmente para verificar se a embalagem da amostra e estabilidade do rotor. Verificar a estabilidade final de fiação do rotor para dentro± 20 Hz. </li><li> Ajuste a sintonia e harmonização capacitores da sonda iterativamente para atingir reflexão mínimo de energia, tanto de 1 H e 13 C RMN freqüências. Regule a temperatura experimental para 25 ° C (ou temperatura ambiente). </li><li> Iniciar o pré-optimizado experimento CPMAS correspondente à condição de Hartmann-Hahn correspondente determinado na frequência de 10 kHz a fiação. </li><li> Adquirir 4096 transientes, a condição do espectro com a linha (Lorentziana) exponencial ampliação de 50-100 Hz, e fazer uma transformada de Fourier para gerar um espectro de RMN de intensidade de sinal versus blindagem química (ppm). </li><li> Referência a 13 química C turnos externamente usando o conjunto de adamantano em 38,4 ppm (-CH 2 - grupo) 8 como padrão. </li><li> Aumentar a frequência do rotor de fiação a 15 kHz e repetir a medição CPMAS (passos 4.6-4.8) correspondente à condição de Hartmann-Hahn correspondente determinada nesta última frequência de girar. </li><li> Repenas experiências CPMAS (passos 4.1-4.9) com amostras de cutícula naturais (ceroso) e parcialmente desparafinados de fruta. </li></ol> 5. Sondagem da superfície da cutícula de Tomate com Microscopia de Força Atômica (Digital Instruments Nanoscope IIIa; procedimentos irão variar entre os microscópios) 6 <ol><li> Ligue o microscópio de varredura por sonda (SPM) (Fig. 2) e certifique-se que o interruptor de modo microscópio alternância é definida como a microscopia de força de contato Atômica (AFM) de modo. </li><li> Manualmente levantar a cabeça SPM girando seus dois botões ajustáveis ​​pelo usuário da frente. Separe o tipholder AFM a partir da cabeça SPM rodando o parafuso de aperto na parte de trás da cabeça. </li><li> Use uma pinça para remover o cantilever AFM existente na tipholder, então, cuidadosamente, pegue um cantilever de nitreto de silício novo (AFM sonda) de seu pacote e instalá-lo no lugar do cantilever de idade. Utilizar um microscópio de luz para verificar que o recém-instalado cantilever AFM não é quebrada. </li><li> Anexar ªe cutícula amostra de tomate (uma seção de cutícula tomate parcialmente desparafinados ~ 10 mm x 10 mm) para um disco de aço inoxidável (amostra puck) com fita dupla face. Utilizar um microscópio de luz para verificar que a superfície cutículas permanece plana e lisa após a colocação da amostra sobre a puck. </li><li> Coloque o puck com a amostra de cutícula de tomate para a região magnética na parte superior do scanner SPM. </li><li> Definir as dianteiras dois parafusos de ajuste manuais do scanner de alta rodando os botões; definir o parafuso de ajustamento motorizado de volta para aproximadamente o mesmo nível como os outros dois parafusos frontais. Certifique-se que todos os três parafusos são suficientemente elevadas para evitar a quebra da ponta do AFM quando colocar a tipholder na cabeça SPM. </li><li> Reinserir o tipholder dentro da cabeça de SPM e fixá-lo apertando o parafuso de aperto na parte de trás da cabeça. </li><li> Depois de ligar o laser, alinhar o ponto de laser sobre o cantilever AFM usando o central (y) e direita (x) botões de ajuste do laser sobre o topo da cabeça.Monitorar o feixe de laser reflectido sobre um pedaço de papel para posicionar o ponto de laser exactamente no final do cantilever de AFM. </li><li> Ajustar a posição do espelho móvel iterativamente usando os botões de ajuste fotodetector para alcançar máxima do sinal (sinal SUM), garantindo assim que o feixe de laser reflectido está a ser recebido uniformemente pelos quatro quadrantes do fotodetector. </li><li> Abaixar a ponta do AFM retraindo os parafusos de ajustamento manual frontal eo parafuso de ajustamento motorizado de trás do scanner SPM, visualmente o controlo da abordagem da ponta AFM em direcção à superfície da amostra com um microscópio invertido. Assegure-se que todos os três parafusos são ao mesmo nível, para evitar artefactos de imagem de uma amostra inclinada. Traga a ponta em direção à amostra, mas não tão perto que os toques de ponta ou rompe a superfície da amostra. </li><li> Neste ponto, a luz laser refletida do cantilever AFM vai saltar fora do espelho móvel para o fotodetector. Para o modo de AFM contacto com um silinitreto de con AFM ponta, definir o sinal de saída (deflexão vertical) de voltagem para -2 V para um valor nominal V 0 eo sinal de DIFF (vertical / horizontal diferença) para 0 V, ajustando a posição do espelho. </li><li> Usando o software Nanoscope, clique no ícone do microscópio e selecionar o perfil adequado (Contato modo AFM). </li><li> Usando o &quot;Controle de Configurações de digitalização de&quot; painel, defina a taxa de varredura e por exemplo, tamanho da digitalização, 10 microns tamanho de digitalização e 2 Hz taxa de varredura. </li><li> Permitir a ponta do AFM para envolver a superfície da amostra, clicando no ícone de envolver-dica. Ao controlar o parafuso de volta motorizada da base SPM, o programa irá agora baixar a ponta até que engata a superfície da amostra. O processo de digitalização será iniciado automaticamente uma vez que a ponta se envolveu com sucesso. </li><li> Monitorar o processo de digitalização usando ambos os modos de imagem e alcance do software, ajustando parâmetros como referência, o ganho integral, ganho proporcional, tamanho da digitalização, velocidade de varredura, as linhas e as amostras por linha iterativamente para atingir o mais altoimagens de alta resolução. Inicie a digitalização com uma gama eixo z grande (escala de dados); então cuidadosamente reduzir o valor da escala de dados para observar o melhor contraste de características de superfície sobre a imagem. Minimizar a ocorrência de áreas brancas da imagem digitalizada, que indicam que a altura das características da superfície superior do intervalo eixo z disponível. </li><li> Capturar a imagem para salvar o arquivo de dados, em seguida, processar os dados usando funções de nivelamento para remover artefatos na imagem devido à deriva do scanner vertical (Z), arcos de imagem, e deslocamento vertical entre linhas de varredura, 9, finalmente, calcular a rugosidade média. Depois de guardar os dados, retrair a ponta do AFM, invertendo a acção do motor de parafuso, controlado por computador que foi usado para acoplar-lo. O processamento de imagem pode ser realizada em modo off-line de análise de imagem e / ou utilizando um computador diferente. </li><li> Use os botões da frente de fundo de metal cinza do titular dica para mudar as posições x e y da área de digitalização, em seguida, repita a medição em cinco loca amostrações para verificar a reprodutibilidade, substituindo o cantilever de AFM se a qualidade da imagem deteriora-se. </li></ol> 6. Os resultados representativos A análise química do deslocamento 13 CPMAS C espectros de RMN (Fig. 3) identificou os grupos funcionais mais importantes presentes no cutícula de tomate exaustivamente desparafinados (cutina). As porções de carbono chave na biopoliéster cutina foram encontrados para ser alifáticos de cadeia longa (0-45 ppm), compostos alifáticos oxigenados (45-110 ppm), multiplicar-colados e aromáticos (110-160 ppm), e carbonilos (160-220 ppm). As porções oxigenados de alquilo (CHO + CH2O) desempenham um papel crucial no estabelecimento de ligações covalentes entre as unidades monoméricas do biopolímero cutina, formando assim a arquitectura molecular da matriz cutina. As diferenças na áreas dos picos relativos observados na região espectral entre 45 e 100 ppm sugerem que a cutina mutante tem uma proporção relativamente elevada de ligações cruzadas formando CHO Structura<html> metades l em comparação com o tipo selvagem cutina; cuidadosas medições quantitativas utilizando polarização directa (DPMAS) RMN 5 métodos apoiar esta inferência (dados não mostrados). CPMAS 13 C espectros de RMN também mostrou um pico de cera progressivamente a decrescer a 31 ppm (Fig. 4), indicando a remoção sequencial de epi e ceras intracuticular a partir do composto cutina cera, mantendo a arquitectura química principal do biopolímero cutina. Análise de imagem paralelo AFM (Fig. 5) revelou irregularidades de superfície devido à extracção por passos de epi e ceras intracuticular da cutícula de fruta, significando alterações na organização do conjunto cuticular. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Figura 1 Soxhlet (fonte da imagem: Wikipedia). &quot;/&gt; Figura 2. A) microscópio da sonda Scanning. B) cabeça SPM (adaptado do manual de treinamento fornecido pela AFM Instrumentos Digitais). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Figura 3. 150 MHz CPMAS 13 C espectro de RMN de exaustivamente desparafinados vermelhas cutículas tomate maduro da fruta (cutins) de tipo selvagem (M82) e mutante (CM15) mostram ressonâncias com deslocamentos químicos correspondentes aos grupos funcionais de um ácido hydroxyfatty reticulada baseado no poliéster e também algumas porções multiplicam ligados. Todos os espectros foram adquiridos com uma frequência de 10 kHz a fiação. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Figura 4. 150 MHz 13 CCPMAS espectros de RMN de comerciais vermelhas cutículas frutos maduros de tomate exibem alterações de composição após a remoção sequencial de ceras e intracuticular por extracção goma arábica mecânico e um two-dip minutos clorofórmio, respectivamente. Todos os espectros foram adquiridos com uma frequência de 15 kHz a fiação. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Imagens Figura 5. AFM e estimativas de rugosidade para o tomate parcialmente desparafinados comercial cutículas descrito na Figura 4, após a remoção progressiva de epicuticulares (esquerda) e intracuticular (à direita) ceras.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os protocolos aqui descritos permitem a caracterização molecular e microescala detalhada de um material vegetal complexo insolúvel sem a necessidade de decomposição química destrutiva. Para investigar a mistura do biopoliéster cutina com diversos lípidos (ceras) que controlam a organização estrutural do conjunto cuticular, 10 realizamos e monitorados procedimentos para a remoção seletiva de ceras epicuticulares e intracuticular de uma mistura heterogênea cuticular. De estado sólido 13 C RMN foi utilizado para medir a extracção de componentes de cera moleculares, e microscopia de força atómica serviu para examinar as alterações concomitantes na rugosidade da superfície. 6,11 Para comparar as capacidades de ligação cruzada de cutins de cultivada de tipo selvagem e único gene frutos de tomate mutantes, de estado sólido 13 C RMN foi também utilizada para estimar os números relativos de CHO e 2 CH porções O químicos. Uma série de característica de projetos deste protocolo são notáveis. À medida que os materiais de cera englobar uma grande variedade de lipidos, tratando a cutícula de frutas com uma série de solventes com polaridades divergentes é essencial para alcançar desparafinação exaustiva. Além disso, o tempo de desparafinagem pode variar de 8 horas a 24 horas, dependendo da natureza das amostras cutícula. Para extrair ceras consistentemente a partir da cutícula fruto intacto, é imperativo para aplicar o revestimento adesivo uniforme para a superfície. De estado sólido CPMAS 13 C RMN 12 é um método rápido para a identificação de qualitativa vários componentes estruturais de biopolímeros vegetais altamente heterogéneos e insolúvel conservando as suas características físicas nativas; 13 RMN solução de estado-tradicional também pode ser usado para caracterizar as misturas de cera extraídos. Se a estimativa quantitativa de grupos funcionais é desejada para os polímeros de plantas intactas, 5 de alta fidelidade de polarização direta magia ângulo de giro (DAMPs) 13 C RMN 5,14 deve ser utilizado como um método complementar. Quantificação precisa dos grupos funcionais requer cuidadosa otimização dos tempos de reciclagem, comprimentos de pulso de excitação, e no poder de dissociação heteronuclear 15. Dissociação O heteronuclear pode ser ajustado para uma intensidade de campo 1 H variando de 50 kHz a 185 kHz usando o TPPM 16 ou COLUNA 7 metodologias. Em adição a estes parâmetros, a sensibilidade das medições CPMAS depende do tempo de spin-lock e Hartmann-Hahn condição de correspondência. 15 Em lugar de CPMAS tradicionais, uma rampa de amplitude CP técnica (RAMP-CP) pode ser implementado para maximizar a cruz -polarização eficiência através da variação da amplitude 1 H linearmente (~ 20-50%) ou tangencialmente ao mesmo tempo manter a amplitude da força do campo 13 C constante durante o período de rotação de bloqueio-(ou vice-versa). 17,18 execução das medições CPMAS em um mínimo de duas ro diferentetor-fiação freqüências é imperativo distinguir bandas laterais fiação dos principais picos espectrais. Medições simultâneas de AFM realizadas no modo de contato permitir imagens diretas do estado da superfície da cutícula com velocidades de digitalização de alta e alta resolução, 19, por exemplo durante a remoção sequencial de componentes cerosos. Operando AFM no aproveitamento (não-contacto) modo pode ser usado como uma alternativa para a caracterização da superfície de delicadas &quot;leves&quot; de materiais vegetais, evitando danos possível devido à laterais (cisalhamento) forças e raspagem da superfície da amostra. 5,20 Em ambos os casos , a aquisição seqüencial de várias imagens do mesmo ponto da superfície serve para identificar qualquer dano na superfície devido a &quot;sonda de superfície interações&quot; nas medidas de AFM. 6,21 Para reprodutibilidade ideal, sondas AFM com constantes de mola adequados para superfícies suaves cuticulares deve ser usado, constância e da temperatura e da umidade deve ser mantida. 6,15,20 </sup&gt; Considerando solid-state NMR oferece um perfil molecular de ensemble médio (a granel) em propriedades cutículas dos frutos do tomateiro, a imagem de força atômica fornece uma sonda complementar não invasivo 22,23 para acompanhar a topografia da superfície destes conjuntos macromoleculares requintadamente complexos 1,2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

A cutícula, uma camada hidrofóbica protecção sobre as partes aéreas das plantas terrestres, funciona como uma barreira versátil defensiva para vários estresses e também regula o fluxo de água a partir do ambiente externo. 1 Um biopoliéster (cutina) e de cadeia longa de ácidos gordos ( ceras) formam o quadro estrutural principal da cutícula; a integridade funcional da camada cuticular depende da camada exterior &#39;epicuticular&#39;, bem como a mistura consistindo do biopolímero cutina e &#39;intracuticular dos ceras Nisto 2, nós descrevemos um protocolo global. para extrair ceras exaustivamente de tomate comercial (Solanum lycopersicum) cutículas de frutas ou para remover ceras e intracuticular seqüencialmente e, seletivamente, a partir do composto cutícula. O método de Jetter e Schaffer (2001) foi adaptado para a extracção por passos de ceras e intracuticular da cutícula fruta. 3,4 Para monitorizar oprocesso de remoção de cera seqüencial, de estado sólido polarização cruzada no ângulo mágico de fiação (CPMAS) 13 C espectroscopia de RMN foi utilizado em paralelo com microscopia de força atômica (AFM), oferecendo em nível molecular perfis estruturais dos materiais a granel, complementados por informações sobre a topografia microescala e rugosidade das superfícies cuticulares. Para avaliar as capacidades de ligação cruzada de cutículas desparafinados de cultivadas do tipo selvagem e de um único gene frutos de tomate mutantes, 13 MAS C RMN foi utilizado para comparar as proporções relativas dos alifático oxigenada (CHO e CH2O) porções químicas. Desparafinação exaustiva por extracção de Soxhlet stepwise com um painel de solventes de diferentes polaridades proporciona um meio eficaz para isolar porções de cera com base nas características hidrofóbicas da sua alifáticos e constituintes aromáticos, preservando a estrutura química do biopoliéster cutina. A extração mecânica de ceras epicuticulares e Seleremoção de ceras ctive intracuticular, quando monitorizado por metodologias complementares físicas, proporciona um meio sem precedentes para investigar a montagem cutícula: esta abordagem revela que a organização supramolecular e integração estrutural de vários tipos de ceras, a arquitectura da matriz cutina cera, e do produto químico composição de cada constituinte. Além disso, de estado sólido 13 C RMN revela diferenças nos números relativos de CHO e 2 CH porções químicas O para tipo selvagem e mutante vermelhos maduros frutos de tomate. As técnicas de RMN oferecem ferramentas excepcionais para a impressão digital do estrutura molecular dos materiais cuticulares que são insolúveis, amorfo, e quimicamente heterogénea. Como técnica de imagem não invasivo superfície seletiva, AFM fornece um meio eficaz e direta para investigar a organização estrutural do conjunto cuticular na escala de comprimento nm m de.

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Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Órgãos das plantas aéreas são protegidos pela cutícula, uma assembléia biopoliéster cera supramolecular. Apresentamos protocolos para monitorar a remoção seletiva de epi-e ceras intracuticular de cutículas dos frutos do tomateiro em escalas moleculares e micro por RMN de estado sólido e microscopia de força atômica, respectivamente, e para avaliar a capacidade de ligação cruzada de engenharia biopolyesters cuticulares.

Isolamento e Estudo de Biofísica de Cutículas Frutas

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K visualizações.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Órgãos das plantas aéreas são protegidos pela cutícula, uma assembléia biopoliéster cera supramolecular. Apresentamos protocolos para monitorar a remoção seletiva de epi-e ceras intracuticular de cutículas dos frutos do tomateiro em escalas moleculares e micro por RMN de estado sólido e microscopia de força atômica, respectivamente, e para avaliar a capacidade de ligação cruzada de engenharia biopolyesters cuticulares.

Vídeo: Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Agressão a estudar em Drosophila (mosca da fruta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...