Essa ferramenta pode ser usada para investigar diferentes mecanismos de sensibilização ao nociceptor, e é essa sensibilização que pode conduzir algumas formas de dor crônica. O rastreamento automatizado de limiares elétricos fornece uma medida confiável, on-line e em tempo real da excitabilidade do nociceptor. Como tal, esta medida fornece uma importante ponte translacional, permitindo que as medições sejam feitas tanto em humanos como em animais.
Da mesma forma, permitindo que patologias e tratamentos eficazes sejam avaliados. No futuro, o AP Track poderá ser usado em pacientes com dor crônica para confirmar se um agente terapêutico está normalizando a excitabilidade de seus nociceptores sensibilizados. Isso representaria um biomarcador crucial de eficácia.
Antecipamos que nosso kit de ferramentas de código aberto, AP Track, será útil para eletrofisiologistas que estudam estímulos de loop temporal de diferentes magnitudes. Por exemplo, também achamos que será útil para estudar optogenética. Gerenciar um experimento e um software simultaneamente é desafiador no início, então recomendo que os usuários carreguem dados pré-gravados no AP Track para se familiarizarem com seu uso antes de tentar um experimento.
Nós fornecemos dados de demonstração. Para começar, conecte a placa de aquisição ao computador usando o cabo fornecido pelo fabricante e ligue-os. Em seguida, conecte a placa de E/S à importação analógica na placa de aquisição e conecte um Intan RHD Recording Headstage à placa de aquisição usando um cabo de Interface Periférica Serial.
Em seguida, conecte o Pulse Pal ao computador. Divida o sinal do canal de saída do Pulse Pal um usando um Divisor BNC T e, em seguida, conecte-o à entrada do estimulador de corrente constante e à placa de E/S, para que o comando de tensão analógica possa ser gravado. Conecte o canal de saída dois do Pulse Pal à placa IO para gravar os marcadores de eventos TTL de estimulação.
Para montar com um estimulador de corrente constante controlado por discagem, ligue um estimulador de corrente constante e conecte a placa de controle do motor de passo ao motor de passo usando o cabo fornecido pelo fabricante e o suporte magnético. Conecte a placa de controle ao computador diretamente usando qualquer cabo USB-A para USB micro B padrão. Conecte a placa de controle e o motor de passo a um suporte de montagem personalizado e ajuste o seletor de amplitude de estimulação no estimulador de corrente constante para zero miliamperes.
Em seguida, conecte um adaptador de barril personalizado ao barril do motor de passo. Conecte o motor de passo e o aparelho de montagem personalizado ao mostrador de amplitude de estimulação no estimulador de corrente constante usando o adaptador de barril e ligue-o. Abra a GUI do AP Track e estabeleça um registro eletrofisiológico estável do nervo periférico.
Identifique o campo receptivo na pele e posicione o eletrodo estimulador lá. No menu Opções, selecione Canal de gatilho e escolha o canal ADC que contém o marcador TTL de estimulação elétrica do canal de saída dois do Pulse Pal. Em seguida, selecione o canal de dados e escolha o canal que contém os dados eletrofisiológicos.
Clique em Conectar para conectar o AP Track ao Pulse Pal e ao aparelho do motor de passo. Isso pode demorar um pouco. Uma vez conectada, a placa de controle do motor de passo se ajustará para a posição zero.
No painel de controle de estimulação, defina as amplitudes mínima e máxima iniciais de estimulação usando o controle deslizante. Certifique-se de que a estimulação atual esteja definida acima de zero, para que os marcadores TTL sejam gerados. Clique em F para carregar um arquivo contendo as instruções de estimulação e, em seguida, clique na seta para a direita para iniciar o paradigma de estimulação carregado.
O gráfico raster temporal começará a ser atualizado com a resposta à estimulação elétrica, com cada nova resposta de estimulação sendo exibida como uma nova coluna à direita. Para detectar com êxito os potenciais de ação de um único neurônio, vá para o painel de gráfico raster temporal e ajuste os valores de limite de imagem baixo, detecção e alto. Com limites de imagem adequados definidos, os eventos de cruzamento de limite detectados pelos algoritmos serão codificados em verde.
Sistematicamente, mova o eletrodo estimulante ao redor da área da pele inervada pelo nervo. Monitore o gráfico raster temporal para três eventos de cruzamento de limiar que aparecem em uma linha na mesma latência enquanto o eletrodo está na mesma posição de estimulação. Isso indica a identificação de um potencial de ação neuronal periférico de latência constante.
Depois de identificar o potencial de ação de neurônio único no gráfico de raster temporal, mova o controle deslizante linear cinza no lado direito do gráfico para ajustar a posição da caixa de pesquisa. Em seguida, ajuste a caixa de pesquisa com o controle deslizante giratório para uma largura apropriada. Reduza a largura da caixa de pesquisa.
Para começar a rastrear o potencial de ação direcionado, clique no sinal de mais abaixo da tabela de rastreamento de várias unidades. Uma nova linha será adicionada à tabela contendo os detalhes do potencial de ação alvo, incluindo o local de latência, a porcentagem de disparos sobre dois a 10 estímulos e a amplitude de pico detectada. O algoritmo de rastreamento de latência será executado automaticamente nele a cada estimulação elétrica subsequente.
Marque a caixa de pico de faixa na tabela para mover a caixa de pesquisa para a posição apropriada para esse potencial de ação específico. Calcular a velocidade de condução do neurônio periférico dividindo a distância entre os locais de estimulação e registro pela latência apresentada na tabela. Para realizar o rastreamento do limiar elétrico, ajuste as taxas de incremento e decremento no painel de controle de estimulação para a taxa desejada.
Mantenha esses valores iguais. Certifique-se de que a frequência de estimulação esteja ajustada para uma taxa adequada, tipicamente 0,25 a 0,5 Hertz. Ajustar manualmente a amplitude de estimulação aproximadamente ao limiar elétrico do neurônio.
Em seguida, marque a caixa de limite de faixa na tabela de rastreamento de várias unidades, que iniciará o algoritmo de rastreamento de limite elétrico. Na tabela de rastreamento de várias unidades, monitore a taxa de disparo. Uma taxa de disparo de 50% indica que o limiar elétrico aproximado foi determinado e o valor limite será atualizado.
Finalmente, aplique uma manipulação experimental no campo receptivo e continue rastreando o limiar elétrico. Isso quantificará as mudanças na excitabilidade do neurônio periférico. Os traços sequenciais de uma fibra C humana do nervo perene superficial durante um experimento de microneurografia e os traços sequenciais de uma fibra A-delta de camundongo do nervo safeno durante a preparação pele-nervo provocada eletrofisiologia da fibra são mostrados nesta figura.
Os traços foram coloridos de vermelho quando um potencial de ação foi identificado, resultando em uma diminuição na amplitude do estímulo. O algoritmo do software efetivamente encontra a amplitude de estímulo necessária para uma probabilidade de 50% de disparo. O rastreamento do limiar elétrico a uma frequência de estimulação de 0,25 Hertz durante a estimulação térmica de um nociceptor de fibra C humana é apresentado nesta figura.
O eixo y codifica o número de estimulação desde o início do paradigma. Os traços de tensão por 4.000 milissegundos após a estimulação elétrica com os eventos de cruzamento do limiar são marcados em vermelho. O traço de tensão ampliado em torno do potencial de ação rastreado é mostrado aqui.
A linha azul vertical é a latência da linha de base da unidade rastreada. A corrente de estimulação comandada pelo AP Track é mostrada nesta figura. A linha azul vertical é o limiar elétrico basal.
O campo receptivo TCS-II de temperatura da sonda termoestimulante é apresentado aqui. À medida que o campo receptivo dessa fibra C sensível ao calor é aquecido pelo estimulador térmico, o limiar elétrico diminui. A escolha dos valores apropriados para a largura da caixa de pesquisa e o limite de detecção é importante, pois eles melhoram significativamente o desempenho do AP Track, reduzindo o impacto do ruído elétrico.
Quantificar o impacto dos agentes terapêuticos na hiperexcitabilidade em nociceptores pode nos ajudar a entender melhor os mecanismos subjacentes à dor crônica. Esperamos que outros pesquisadores utilizem esta ferramenta disponível gratuitamente para melhor compreender a biologia nociceptiva e as mudanças que ocorreram durante a sensibilização aos nociceptores.
