Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network &#8220;C7&#8221;, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology &#8220;ENLIGHTENMENT&#8221; project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as recomendações e orientações do Comitê do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade de Antuérpia Ética. Este protocolo requer a preparação de um material não-sensível a partir do cérebro de ratos Wistar explantado juvenis, obtido por técnicas de eutanásia humanas aprovados. 1. Equipamentos Preparação <ol><li> Instalar e configurar a aquisição de dados e sistema de estimulação. <ol><li> Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electrofisiológico. NOTA: Comedi é um módulo de Linux e biblioteca que suporta uma grande variedade de cartões de aquisição de dados dos fabricantes mais comuns: visitar http://www.comedi.org para mais informações. </li><li> No caso de um amplificador de patch clamp controlado por computador está em uso, empregar um segundo PC além do uma dedicada ao amplificadorao controle. NOTA: Enquanto o último pode executar um sistema operativo convencional, o PC extra será operar em tempo real por meio de um sistema especial de funcionamento. Nestas condições, é conveniente usar um único monitor, mouse e teclado conectado ao PC extra, durante a conexão por um aplicativo de desktop remoto para o PC dedicado. </li><li> Baixe a imagem ISO do Live CD que contém um sistema operacional em tempo real com Linux pré-instalado da LCG http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e queimá-lo em um CD ou USB vara em branco &quot; . </li><li> Basta inserir o CD no drive do PC que contém o cartão DAQ e iniciá-lo. Como alternativa, instale LCG do seu repositório fonte on-line em um PC rodando o sistema operacional Linux (por exemplo, Debian ou Ubuntu). Consulte o manual online para obter detalhes sobre o procedimento de instalação. O manual está disponível online em http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Arrancar a partir do CD ao vivo: this carregará automaticamente um sistema totalmente configurado. Para fazer isso, coloque o Live CD do LCG no computador unidade de CD-ROM e inicialize o computador a partir do CD; selecionar o kernel de tempo real (opção padrão), logo que o menu de inicialização aparecer e aguarde o sistema para inicializar. </li><li> Calibrar o cartão DAQ, digitando no prompt de comando: sudo comedi_calibrate ou sudo comedi_soft_calibrate dependendo se a placa de aquisição de dados suporta calibração de hardware ou software, respectivamente (use o comando sudo comedi_board_info para obter informações sobre a bordo). </li><li> Defina o conversor analógico-digital adequada e de digital para analógico factores de conversão: este exige ter acesso ao manual do amplificador eletrofisiológico celular e, particularmente, com as respectivas especificações nos seus factores de conversão. </li><li> Use um editor de texto para especificar os valores numéricos apropriados no /home/user/.lcg-env arquivo, para as variáveis ​​de ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTA: Estes representam a entrada (AI) e de saída (AO) ganhos para alicate de corrente (CC) ea braçadeira de tensão (VC) modos, e os fatores de conversão entre os comandos de tensão fornecidas pelo computador e que o actual ou tensões geradas pelo amplificador , respectivamente. </li><li> Como alternativa, use o script LCG fornecida (LCG-achado-conversão-factores), para encontrar os fatores de conversão de seu sistema. NOTA: Os valores calculados pela LCG-encontrar-conversão-fatores são suposições, que em alguns casos são necessários para ser numericamente truncado ou arredondados para refletir os valores exatos dos factores de conversão. </li><li> Para usar lcg encontrar-conversão-fatores, comece conectando a &quot;célula modelo&quot;, que muitas vezes é comprado com o amplificador para o headstage correspondente. Em seguida, abra um terminal na máquina Linux onde você está executando o Live CD e digite o seguinte comando no prompt shell: lcg-encontrar-conversão-fatores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTA: Em ambos os casos (ou seja, modificação manual de /home/user/.lcg-env ou uso de LCG-achado-conversão-factores), fechar e abrir o terminal para que as alterações tenham efeito. </li><li> Se forem usadas várias headstages, defina os fatores de conversão para os mesmos valores em todos os canais; se isso não for possível, consulte o manual online LCG para entender como usar vários factores de conversão em LCG-estímulo ou como produzir arquivos de configuração que melhor se adequam às necessidades do usuário. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de fatias do cérebro do aguda do córtex somatossensorial <ol><li> Preparação de soluções para eletrofisiologia. <ol><li> Preparar fluido cerebrospinal artificial (ACSF) através da mistura de (em mM) 125 de NaCl, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 de glucose, 2 CaCl2, 1 MgCl2 e. Prepare 10x soluções estoque para reduzir oo tempo de preparação, no dia da experiência. Preparar 2 L, dos quais um será usado para a preparação das fatias e a outra para a gravação. </li><li> Saturar o ACSF com 95% de O2 e 5% de CO 2 durante pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento. </li><li> Para gravações de controle de corrente, usar uma solução intracelular (ICS) contendo (em mM) 115 de K-gluconato, KCl 20, 10 de HEPES, 4 de ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar a solução em gelo e filtrá-la antes do início das gravações para eliminar o risco de entupimento da pipeta. </li></ol></li><li> Extracção do cérebro. <ol><li> Anestesiar o animal colocando o animal em uma câmara de indução com 4% de isoflurano e rapidamente decapitar-lo usando uma guilhotina ou tesouras grandes. </li><li> Corte a pele ao longo da linha média e deslize-o para os ouvidos. </li><li> Usando um belo par de tesouras cortou o crânio ao longo da linha média. Mantenha a lâmina mais perto possível para poe a superfície de modo a minimizar os danos no cérebro subjacente. Abra o crânio com um par de pinças, utilizar uma espátula para separar o nervo óptico e do tronco cerebral e do cérebro cair suavemente em ACSF gelado. </li><li> Separa-se o cerebelo e os dois hemisférios com um bisturi (lâmina 24). </li><li> Remover o excesso de água a partir de um dos dois hemisférios e colá-la sobre uma plataforma inclinada utilizando uma gota de supercola. Rapidamente adicionar algumas gotas de ACSF sobre o cérebro e transferi-lo para a câmara de vibratome. NOTA: Ao preparar fatias sagital, o ângulo da plataforma é importante para evitar danificar os dendritos das células piramidais durante o procedimento de corte. </li></ol></li><li> Preparação das fatias. <ol><li> Posicione a lâmina sobre o cérebro e descartar o primeiro 2,5-3 mm. Ajustar a velocidade e frequência para limitar os danos à superfície da fatia e, ao mesmo tempo, minimizando o tempo necessário para o procedimento de corte. </li><li> Defina a espessura de 300 μm e começar a cortar. Uma vez que a lâmina foi passado o córtex, utilizar uma lâmina de barbear ou de uma agulha dobrada para cortar acima do hipocampo e nas bordas da área cortical de interesse. </li><li> Coloque as fatias numa câmara de incubação de poços múltiplos mantida a 32-34 ° C. </li><li> Retrair a lâmina e repita pontos 2.3.2 e 2.3.3 até 5-8 fatias são cortadas. Os melhores fatias são normalmente aqueles em que os vasos sanguíneos são paralelas à superfície. </li><li> Incubam-se as fatias durante 30 min após a última fatia é colocado na câmara. </li></ol></li></ol> 3. Gravações patch-clamp de Camada 5 piramidais neurônios <ol><li> Coloque uma fatia na câmara de gravação e procurar células saudáveis. Estas células normalmente têm menos contraste, uma aparência suave e não estão inchados. </li><li> Inspeccionar a fatia sob o microscópio com a lente de ampliação de 40X e procurar as células em 5 camada, localiza-se, aproximadamente, 600 a 1000 um a partir da superfície do cérebro. </li&gt; <li> Uma vez que uma célula adequada, a carga de um terço da micropipeta com o ICS e colocá-lo no andar de entrada. </li><li> No computador pessoal executando o CD ao vivo ou o sistema operacional Linux pré-configurado, abra um shell de comando (por exemplo, bash) e pelo seu tipo prompt de comando LCG-zero. Isso garante que a placa DAQ não está dirigindo o amplificador. </li><li> Aplicar 30 - 50 mbar de pressão positiva, pressionando o pistão de uma seringa comum, ligada por tubagem para o suporte da pipeta e, com a ajuda de um microscópio, colocar a pipeta de aproximadamente 100 mm acima da fatia. NOTA: Coloque a pipeta numa posição que permite uma via directa para a célula alvo, de preferência usando o modo de abordagem do micromanipulador. </li><li> Agindo sobre os controles do amplificador eletrofisiologia, ajustar o deslocamento pipeta e saída de um pulso de teste (10 mV) no modo braçadeira de tensão. </li><li> Reduzir a pressão para 10 - 30 mbar (dependendo do tamanho da pipeta), retirando oêmbolo da seringa; aproximar suavemente a célula e verificar a formação de uma ondulação, observando a imagem no monitor da câmara de vídeo. Monitore o pulso de teste para um aumento da resistência em todos os momentos, observando a forma de onda atual exibida no osciloscópio ligado ao amplificador eletrofisiologia (alternativamente, você pode usar o LCG-seal-teste de comando para monitorar a resistência pipeta). </li><li> Libertar a pressão e, se necessário aplicar pressão negativa suave para a pipeta para ajudar a formação de selo quando se detectar um aumento na resistência da pipeta e a formação de uma &quot;ondulação&quot; na célula. </li><li> Enquanto as formas de vedação, gradualmente, diminuir o potencial de realização de -70 mV. </li><li> Uma vez que um selo gigaohm tenha sido obtida, garantir que a corrente de retenção é entre 0-30 pA. Aplicar pulsos curtos de pressão negativa (sucção) para quebrar a membrana e estabelecer a configuração de célula inteira. Alternativamente, você pode injetar pulsos fortes e breves de tensão ( <em&gt; isto é, utilizando o comando &quot;ZAP&quot; no amplificador ou segurando a célula em muito negativa) para romper a membrana, dependendo da preparação e pipeta de vidro utilizado. </li><li> Alternar para o modo pinça de corrente e verificar se o potencial de repouso da membrana é típica de uma célula saudável. Para neurônios piramidais corticais usando uma solução baseada em potássio-gluconato, este valor é geralmente entre -65 e -75 mV. </li></ol> 4. Caracterização semi-automática de Imóveis resposta elétrica do neurônio <ol><li> Crie um diretório para armazenar os dados do usuário. A fim de fazer isso a empregar um script incluído no LCG vivo CD que cria pastas com base na data. Para usá-lo, digite no prompt de comando cd ~ / experiências LCG-criar-experimento-pasta-s psp, in_vivo_like Isto irá criar uma pasta onde os dados para essa célula será salvo (e um &#39;psp&#39; e &#39;in_vivo_like&#39; subpastas) e ele irá imprimir o seu nome para o terminaljanela; também é possível armazenar informações adicionais, tais como a resistência da pipeta e tipo de célula usando este script. </li><li> Altere o diretório para a pasta recém criada usando o comando cd ~ / &lt;foldername&gt; O nome da pasta é a que é exibida pelo comando LCG-criar-experimento de pasta e terão o carimbo de hora do dia atual (ou seja, ano-mês-dia), como em 20140331A01. </li><li> Certifique-se de que o amplificador é configurado para operar no modo de alicate de corrente, de que os cabos estão conectados e de comando externo de tensão do amplificador, se presente, está habilitado. </li><li> Digite o comando LCG-ecodeat prompt de comando. Isso exige uma série de comandos (ou seja LCG-ap, lcg-vi, lcg-ramp, lcg-tau e LCG-passos), utilizado para caracterizar as propriedades básicas de resposta da célula. LCG-ecode requer que o utilizador especificar dois parâmetros: a amplitude do 1 ms de duração de impulso de corrente usada para induzir um único pico na célula, e a amplitude máxima da corrente de carneirop injectado para dentro da célula para encontrar a sua reobase. Use a seguinte sintaxe de comando: LCG-ecode --pulse-amplitude X---ramp amplitude Y com uma escolha dos valores de x e Y (em Pa) que são suficientes para tornar o fogo de células em resposta a um 1 ms de duração de pulso e uma injecção de corrente contínua, respectivamente. NOTA: Estes protocolos exigem a execução da estimativa numérica do &#39;kernel do eléctrodo &quot;, a fim de usar o eletrodo de Compensação Ativa (AEC) 15. A injeção de corrente ruidosa é usado para estimar o kernel eo usuário é solicitado a confirmar o número de amostras que compõem o kernel. Veja 15 para obter informações detalhadas sobre o significado do kernel do eletrodo e como escolher o número de amostras do kernel. </li></ol> 5. Injeção de condutância através simulados Sinapses e Simulação de In Vivo -como Atividade Fundo <ol><li> A injeção de potenciais pós-sinápticos excitatórios simulados <ol><li>Mude para o diretório onde você irá salvar o próximo experimento, digitando o seguinte comando no prompt de comando do shell: psp cd / 01 </li><li> Copiar um arquivo de configuração de LCG para o diretório atual e abri-lo com um editor de texto (Nano neste exemplo), digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell (este arquivo de configuração exemplo está incluído no código fonte eo cd ao vivo) : cp ~ / local / src / lcg / configurações / epsp.xml nano epsp.xml NOTA: Este é simplesmente um ficheiro de texto com diferentes entidades ligadas uma à outra. Para mais detalhes veja a seção Resultados Representante. </li><li> Se necessário editar o inputChannel, outputChannel, o inputConversionFactor eo outputConversionFactor neste arquivo para coincidir com a configuração do usuário. </li><li> Calcule o kernel eletrodo necessário para executar a compensação eletrodo ativo &#39;o método utilizado pela LCG para executar eletrodo único grampo dinâmico &quot;, emitindo o command LCG-kernel Isto irá pedir para o número de pontos do kernel. Novamente, seleccionar um número de modo a que o núcleo de eléctrodo cobre a extremidade da cauda de decaimento exponencial. </li><li> Realizar o experimento braçadeira dinâmica usando o comando LCG-experimentar epsp.xml -c </li><li> Listar os arquivos e visualizar os resultados usando o comando ls -l LCG-plot--f arquivo último </li></ol></li><li> Injeção de potenciais pós-sinápticos inibitórios simulados <ol><li> Crie uma pasta e copiar o arquivo para epsp.xml-lo digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Edite o arquivo de configuração usando um editor de texto: mudar o potencial reversão sináptica e subir e tempo de decaimento constantes do Exp2Synapse modelo sinapse para o seguinte: parâmetros&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;parâmetros&gt; Saia do editor de texto. </li><li> Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: LCG-kernel LCG-experimentar ipsp.xml -c </li><li> Listar os arquivos e visualizar os resultados, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: ls -l LCG-plot-arquivo -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulação de in vivo -como atividade de fundo: <ol><li> Mude para o diretório onde você deseja salvar o seguinte experimento, conforme demonstrado anteriormente, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copie o arquivo de configuração do directório de origem LCG, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: cp ~ / local / src / lcg / configurações / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; NOTA: Este arquivo é simplesmente a concatenação dos anteriores; dois processos de Poisson pontos que geram trens ponto, que por sua vez alimentam inibitórios e excitatórios sinapses modelo, geram a atividade de fundo. </li><li> Ajustar os parâmetros de configuração DAQ para a configuração do usuário, conforme descrito no ponto 5.1.3 e saia do editor. </li><li> Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: LCG-kernel LCG-experimentar in_vivo_like.xml -c -n -i 10 3 Os interruptores &#39;-n 10&#39; e &#39;-i&#39; 3 indicam que a estimulação deve ser repetida 10 vezes em intervalos de três segundos. </li><li> Visualize os traços matérias por usando o seguinte comando no prompt de comando do shell: LCG-plot-arquivo -f tudo </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+visual+motion+and+locomotion+in+mouse+visual+cortex.">Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex.</a> Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).</li><li>Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+neuronal+dynamics+during+motor+adaptation+in+zebrafish.">Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish.</a> Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).</li><li>Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-loop+optogenetic+control+of+thalamus+as+a+tool+for+interrupting+seizures+after+cortical+injury.">Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury.</a> Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).</li><li>Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+response+clamp.">Neuronal response clamp.</a> Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).</li><li>Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Command-line+cellular+electrophysiology+for+conventional+and+real-time+closed-loop+experiments.">Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments.</a> Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).</li><li>Sharp, A., O&#8217;Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).</li><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).</li><li>Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+effects+of+the+persistent+Na++current+on+neuronal+excitability+and+spike+timing.">Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing.</a> Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).</li><li>White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+from+voltage-gated+ion+channels+may+influence+neuronal+dynamics+in+the+entorhinal+cortex.">Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex.</a> Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).</li><li>Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+synaptic+conductances+recreate+in+vivo-like+activity+in+neocortical+neurons.">Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons.</a> Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).</li><li>Fellous, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Persistent+Activity+by+Background+Inhibition+in+an+In+Vitro+Model+of+a+Cortical+Microcircuit.">Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit.</a> Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).</li><li>Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+excitability+over+extended+timescales+in+cultured+cortical+neurons.+The+Journal+of+neuroscience.">Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience.</a> the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).</li><li>Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological+and+molecular+properties+of+Martinotti+cells+in+the+somatosensory+cortex+of+the+juvenile+rat.">Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat.</a> The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).</li><li>Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+molecular+and+circuit+properties+of+nest+basket+cells+in+the+developing+somatosensory+cortex).">Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex).</a> Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).</li><li>Brette, R., Piwkowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intracellular+recordings+using+a+real-time+computational+model+of+the+electrode.">High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode.</a> Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).</li><li>Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+closed-loop+presentation+of+sensory+stimuli+conditional+on+the+internal+brain-state+of+awake+animals.">A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals.</a> Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).</li><li>Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo,+low-resistance,+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain.">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).</li><li>Graham, L., Schramm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Dynamic-Clamp+Manipulation+of+Extrinsic+and+Intrinsic+Conductances:+Functional+Roles+of+Shunting+Inhibition+and+I+BK+in+Rat+and+Cat+Cortex.">In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex.</a> Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping. , (2002).</li><li>Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li><li>Gold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Axon Guide for Electrophysiolog., &amp; Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).</li><li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons.">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li><li>Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity.">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li><li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).</li><li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells.">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network.">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li><li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+networks+with+dynamic+synapses.">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li><li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex.">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neste texto um protocolo completo para a aplicação em tempo real, em circuito fechado célula única experimentos eletrofisiológicos foi descrito, utilizando a técnica de patch-clamp e uma caixa de ferramentas de software recentemente desenvolvido chamado LCG. Para otimizar a qualidade das gravações é crucial que a configuração de gravação ser devidamente fundamentada, blindado e vibração livre: Isso garante o acesso de células inteiras estável e duradoura para o celular, que, juntamente com a possibilida...

<html> Nos últimos anos, electrofisiologia celular evoluiu a partir do paradigma de ciclo aberto tradicional utilizado em experiências de tensão e de corrente de fixação com os protocolos de circuito fechado modernos. A técnica de circuito fechado mais conhecido é talvez o grampo dinâmico 6,7, o que permitiu a injecção sintética de canais artificiais dependentes da voltagem de íons para determinar a voltagem da membrana neuronal 8, o estudo em profundidade dos efeitos da não-determinístico piscando em canais iônicos sobre a dinâmica de resposta neuronal 9, bem como a recriação in vitro de realista em vivo- como atividade fundo sináptica 10. Outros paradigmas de circuito fechado que foram propostas incluem o grampo reactivo 11, para estudar in vitro a geração de actividade persistente auto-sustentado, e a resposta braçadeira 4,12, para investigar os mecanismos celulares excitabilidade neuronal subjacente. ontent &quot;&gt; Descrevemos aqui um quadro poderosa que permite a aplicação de uma variedade de protocolos electrofisiológicas de circuito fechado no contexto de gravações de células inteiras patch clamp realizados em fatias cerebrais agudas. Mostramos como gravar tensão somática membrana por meio de gravações de patch clamp em neurônios piramidais do córtex somatossensorial de ratos jovens e aplicar três protocolos de circuito fechado diferentes usando LCG, uma caixa de ferramentas de software baseado em linha de comando desenvolvido no laboratório de Neurobiologia e teórico Neuroengineering. Resumidamente, os protocolos descritos são, em primeiro lugar a injecção automática de uma série de formas de onda de corrente de fixação de estímulo, relevantes para a caracterização de um grande conjunto de propriedades da membrana activas e passivas. Estes têm sido sugeridos para capturar o fenótipo electrofisiológico de uma célula em termos das suas propriedades de resposta a uma série de formas de onda de estímulo estereotipado. Conhecido como o e-code de uma célula (por exemplo, ver &amp; #160; 13,14), como um conjunto de respostas eléctricas é utilizado por vários laboratórios para classificar objectivamente neurónios na base das suas propriedades eléctricas. Isto inclui a análise da relação de transferência de entrada-saída estacionária (curva FI), por uma técnica inovadora que envolve o circuito fechado, o controlo em tempo real da taxa de disparo por meio de um regulador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo a recriação da in vivo -como fundo atividade sináptica realista em preparações in vitro 10 e, em terceiro lugar a conexão artificial em tempo real de dois neurônios piramidais gravados simultaneamente por meio de um interneurônio GABAergic virtual, que é simulada pelo computador. Além disso, LCG implementa a técnica conhecida como Ativo Eletrodo Compensação (AEC) 15, que permite a implementação de protocolos de fixação dinâmicos usando um único eletrodo. Isto permite compensar os efeitos indesejáveis ​​(umrtifacts) do eléctrodo de registo que surgem quando é utilizado para a entrega de estímulos intracelulares. O método baseia-se numa estimativa não-paramétrico de as propriedades equivalentes eléctricos do circuito de gravação. As técnicas e protocolos experimentais descritos no presente documento podem ser facilmente aplicadas na tensão de circuito aberto convencional e experiências de fixação de corrente e pode ser alargado a outras preparações, tais como extracelular 4,16 ou gravações intracelulares, in vivo 17,18. A montagem cuidadosa da configuração para fixação de membranas de células inteiras eletrofisiologia é um passo muito importante para, gravações de alta qualidade estáveis. A seguir vamos supor que uma configuração tal experimental já está disponível para o experimentador, e concentrar a nossa atenção na descrição do uso de LCG. O leitor é apontado 19-22 por mais dicas sobre otimização e depuração.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>1.5/0.84 mm OD/ID, with filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>20 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMLFS</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6229</td>
			<td>Supported by Comedi Linux Drivers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010 Tower</td>
			<td>OS: real-time Linux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Pump</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>MINIPULS3</td>
			<td>Used with R4 Pump head (F117606)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>TC02</td>
			<td>PH01 Perfusion Cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Testo</td>
			<td>510</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>ACSF, ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51120</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time electrophysiology: using closed-loop protocols to probe neuronal dynamics and beyond

Neuroscience experimental está a assistir um interesse crescente no desenvolvimento e aplicação de protocolos de novos e muitas vezes complexas, em circuito fechado, onde o estímulo aplicado depende em tempo real sobre a resposta do sistema. Aplicações recentes vão desde a implementação de sistemas de realidade virtual para o estudo de respostas motoras, tanto em camundongos e em um peixe-zebra 2, para controlar de convulsões seguintes acidente vascular cerebral cortical usando a optogenética 3. Uma das principais vantagens das técnicas de circuito fechado reside na capacidade de sondagem propriedades dimensionais mais altos que não estão directamente acessíveis ou que dependem de várias variáveis, tais como a excitabilidade neuronal 4 e fiabilidade, ao mesmo tempo maximizar a taxa de transferência experimental. Neste contribuição e no contexto de electrofisiologia celular, que descrevem como a aplicação de uma variedade de protocolos de circuito fechado para o estudo das propriedades de resposta de neurónios piramidais corticais, recorded intracelularmente com a técnica de patch clamp em fatias cerebrais agudas do córtex somatossensorial de ratos jovens. Como nenhum software de código aberto disponíveis comercialmente ou fornece todos os recursos necessários para desempenhar eficazmente as experiências descritas aqui, uma nova caixa de ferramentas de software chamado LCG 5 foi desenvolvido, cuja estrutura modular maximiza a reutilização de código de computador e facilita a implementação de novos paradigmas experimentais. Formas de onda de estimulação são especificados usando uma meta-descrição compacta e protocolos experimentais completos estão descritos nos arquivos de configuração baseados em texto. Além disso, LCG tem uma interface de linha de comando que é adequado para a repetição de ensaios e automação de protocolos experimentais.

Nas seções anteriores, descrevemos como usar a caixa de ferramentas de software LCG para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas de células piramidais L5 e recriar in vivo -como atividade sináptica em uma preparação fatia. O uso de uma interface de linha de comando e protocolo semi-automatizado favorecer a reprodutibilidade e a eficiência da experiência, o que pode ter um grande impacto sobre a produção e a qualidade dos dados produzidos. Além disso, uma vez que os dados são guardados de um...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond at JoVE.com

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K visualizações.  University of Antwerp. Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board. 

Vídeo: Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Uma Plataforma Experimental para Estudo de Desempenho de circuito fechado de interfaces cérebro-máquina

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Neurociência

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic effects of drugs and downstream pathways involved would help gain insight into the molecular mechanisms of neuroprotection/neurotoxicity and could potentially facilitate drug development. However, many existing in vitro toxicity assays have major limitations &#8211; most assess neurotoxicity and neuroprotection at a single time point, not allowing to observe the time-course and kinetics of the effect. Furthermore, the opportunity to collect information about downstream signaling pathways involved in neuroprotection in real-time would be of great importance. In the current protocol we describe the use of a real-time impedance-based cell analyzer to determine neuroprotective effects of serotonin 2A (5-HT2A) receptor agonists in a neuronal cell line under label-free and real-time conditions using impedance measurements. Furthermore, we demonstrate that inhibitors of second messenger pathways can be used to delineate downstream molecules involved in the neuroprotective effect. We also describe the utility of this technique to determine whether an effect on cell proliferation contributes to an observed neuroprotective effect. The system utilizes special microelectronic plates referred to as E-Plates which contain alternating gold microelectrode arrays on the bottom surface of the wells, serving as cell sensors. The impedance readout is modified by the number of adherent cells, cell viability, morphology, and adhesion. A dimensionless parameter called Cell Index is derived from the electrical impedance measurements and is used to represent the cell status. Overall, the real-time impedance-based cell analyzer allows for real-time, label-free assessment of neuroprotection and neurotoxicity, and the evaluation of second messenger pathways involvement, contributing to more detailed and high-throughput assessment of potential neuroprotective compounds in vitro, for selecting therapeutic candidates.

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

De circuito fechado experiências neuro-robótico para testar as propriedades computacionais da Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems are already found in clinical applications, and are important tools for basic brain research. A particularly interesting recent development is the integration of closed-loop approaches with optogenetics, such that specific patterns of neuronal activity can trigger optical stimulation of selected neuronal groups. However, setting up an electrophysiological system for closed-loop experiments can be difficult. Here, a ready-to-apply Matlab code is provided for triggering stimuli based on the activity of single or multiple neurons. This sample code can be easily modified based on individual needs. For instance, it shows how to trigger sound stimuli and how to change it to trigger an external device connected to a PC serial port. The presented protocol is designed to work with a popular neuronal recording system for animal studies (Neuralynx). The implementation of closed-loop stimulation is demonstrated in an awake rat.

This protocol demonstrates how to use an electrophysiological system for closed-loop stimulation triggered by neuronal activity patterns. Sample Matlab code that can be easily modified for different stimulation devices is also provided.

Usando a atividade de spiking do neurônio para provocar estímulos do Closed-Loop em experiências neurophysiological

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in acute and chronic pain conditions. This produces abnormal ongoing activity or reduced activation thresholds to noxious stimuli. Identifying the cause of this increased excitability is required for the development and validation of mechanism-based treatments. Single-neuron electrical threshold tracking can quantify nociceptor excitability. Therefore, we have developed an application to allow such measurements and demonstrate its use in humans and rodents. APTrack provides real-time data visualization and action potential identification using a temporal raster plot. Algorithms detect action potentials by threshold crossing and monitor their latency after electrical stimulation. The plugin then modulates the electrical stimulation amplitude using an up-down method to estimate the electrical threshold of the nociceptors. The software was built upon the Open Ephys system (V0.54) and coded in C++ using the JUCE framework. It runs on Windows, Linux, and Mac operating systems. The open-source code is available (<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/Microneurography/APTrack&amp;source=gmail&amp;ust=1680789829274000&amp;usg=AOvVaw0nMk9J_EI2jUn8SlmC5JJm" href="https://github.com/Microneurography/APTrack" target="_blank">https://github.com/Microneurography/APTrack</a>). The electrophysiological recordings were taken from nociceptors in both a mouse skin-nerve preparation using the teased fiber method in the saphenous nerve and in healthy human volunteers using microneurography in the superficial peroneal nerve. Nociceptors were classified by their response to thermal and mechanical stimuli, as well as by monitoring the activity-dependent slowing of the conduction velocity. The software facilitated the experiment by simplifying the action potential identification through the temporal raster plot. We demonstrate real-time closed-loop electrical threshold tracking of single-neuron action potentials during&#160;in vivo&#160;human microneurography, for the first time, and during&#160;ex vivo&#160;mouse electrophysiological recordings of C-fibers and A&#948;-fibers. We establish proof of principle by showing that the electrical threshold of a human heat-sensitive C-fiber nociceptor is reduced by heating the receptive field. This plugin enables the electrical threshold tracking of single-neuron action potentials and allows the quantification of changes in nociceptor excitability.

APTrack is a software plugin developed for the Open Ephys platform that enables real-time data visualization and the closed-loop electrical threshold tracking of neuronal action potentials. We have successfully used this in microneurography for human C-fiber nociceptors and mouse C-fiber and A&#948;-fiber nociceptors.

Rastreamento de limiar elétrico de circuito fechado em tempo fechado de código aberto para pesquisa translacional da dor

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in ...

Estimulação cerebral profunda para tratamento da depressão maior

Closed-Loop Neurostimulation for Biomarker-Driven, Personalized Treatment of Major Depressive Disorder

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major depressive disorder (MDD), most studies to date have administered continuous or open-loop stimulation with promising but mixed results. One factor contributing to these mixed results may stem from when the stimulation is applied. Stimulation administration specific to high-symptom states in a personalized and responsive manner may be more effective at reducing symptoms compared to continuous stimulation and may avoid diminished therapeutic effects related to habituation. Additionally, a lower total duration of stimulation per day is advantageous for reducing device energy consumption. This protocol describes an experimental workflow using a chronically implanted neurostimulation device to achieve closed-loop stimulation for individuals with treatment-refractory MDD. This paradigm hinges on determining a patient-specific neural biomarker that is related to states of high symptoms and programming the device detectors, such that stimulation is triggered by this read-out of symptom state. The described procedures include how to obtain neural recordings concurrent with patient symptom reports, how to use these data in a state-space model approach to differentiate low- and high-symptom states and corresponding neural features, and how to subsequently program and tune the device to deliver closed-loop stimulation therapy.

Autor em destaque: Benefício terapêutico da estimulação cerebral profunda em circuito fechado no tratamento da depressão 

Deep brain stimulation triggered by a patient-specific neural biomarker of a high-symptom state may better control symptoms of major depressive disorder compared to continuous, open-loop stimulation. This protocol provides a workflow for identifying a patient-specific neural biomarker and controlling the delivery of therapeutic stimulation based on the identified biomarker.

Neuroestimulação de ciclo fechado para tratamento personalizado e orientado por biomarcadores do transtorno depressivo maior

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major ...