Este estudo foi financiado por uma bolsa da JSPS KAKENHI (Grant No. 23390072 e 19K07335) e AMED (Grant No. A-149).

Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas para experimentos com animais da Kansai-Medical University e foram aprovados pelos comitês de ética (número de aprovação: 23-104). Todos os animais foram criados sob um ciclo claro-escuro constante em um ambiente específico livre de patógenos. Todos os instrumentos cirúrgicos esterilizados, como tesouras, pinças e afastadores, foram autoclavados e secos completamente.
1. Preparo das bolas de cardiomiócitos neonatais de ratos
<ol><li>Coleção cardíaca neonatal de ratos<ol><li>Para a coleta do coração, seguir procedimento semelhante ao descrito em relato anterior7.</li>
		<li>Imergir ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais (0-2 dias após o nascimento) em soluções de iodopovidona e etanol a 70% sequencialmente e, em seguida, transferi-los para um estojo hermético preenchido com isoflurano vaporizado (a concentração deve ser superior a 10% v/v) para anestesia profunda.</li>
		<li>Após a confirmação da inconsciência por uma perda de atividade locomotora, decapitar o rato enquanto segura o corpo das costas com a mão e, em seguida, cortar 2-4 mm de tecido do centro frontal da caixa torácica para o caudal e, em seguida, na direção rostral usando tesoura afiada.</li>
		<li>Segure a pele traseira para abrir o corte e empurrar o coração da caixa torácica. Corte os ventrículos usando tesoura e mergulhe-os em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio (PBS(−)).</li>
	</ol></li>
	<li>Dispersão dos cardiomiócitos neonatais de ratos<ol><li>Picar os ventrículos coletados dispersos em uma quantidade mínima de buffer de Ads (buffer de Ads: NaCl 116 mM, HEPES 20 mM, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM de glicose, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) em um vidro côncavo autoclavado em pequenos pedaços (1 mm x 1 mm) usando tesoura curva.</li>
		<li>Transferir os tecidos picados e um agitador micromagnético para um tubo de centrifugação de 50 mL e dispersar os tecidos em células únicas com colagenase a 0,1%, tripsina a 0,1%, DNase I 20 μg/mL e éster metílico de tetrametilrodamina 50 nM em tampão Ads a 37 °C, agitando por 30 min.</li>
		<li>Separe os agregados e as células dispersas através da sedimentação natural, colete apenas as células dispersas em um tubo e digerir os agregados celulares residuais novamente com o mesmo meio de digestão.</li>
		<li>Continue este procedimento até que todas as células estejam completamente dissociadas. Para confirmar a dispersão completa das células, observe os tubos ao microscópio (lente objetiva 4x).</li>
		<li>Coletar as células dispersas usando centrifugação a 150 x g por 5 min e dissociá-las em 1-2 mL de tampão Ads.</li>
	</ol></li>
	<li>Triagem celular ativada por fluorescência de cardiomiócitos<ol><li>Analise as células usando a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usando filtros passa-banda de 556-601 nm para detectar sinais de fluorescência vermelha.</li>
		<li>Realizar cuidadosamente o pré-confinamento para eliminar as frações duplas14. As configurações do portão para eliminação dupla devem estar de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Defina a dispersão direta no eixo x e o sinal de fluorescência vermelho no eixo y. Três populações foram observadas: uma população mais baixa contendo eritrócitos e células mortas, uma população média contendo não-cardiomiócitos, incluindo fibroblastos e células endoteliais, e uma população superior contendo cardiomiócitos ventricularespuros7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de bolas de cardiomiócitos marcadas com fluorescência vermelha<ol><li>Classificar seletivamente os cardiomiócitos e centrifugar por 5 min a 150 x g. Dissolver completamente os pellets celulares em 1 mL de meio essencial mínimo modificado alfa (alfa-MEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor.</li>
		<li>Medir a concentração celular usando um hemocitômetro e diluir a solução de suspensão celular para 3.000 células/mL com alfa-MEM 10% FBS.</li>
		<li>Distribuí-los em placas celulares não adesivas de 96 poços (100 μL por poço), centrifugar por 5 min a 100 x g e cultura para 2-3 d em incubadora de cultura celular com 5% de CO2 a 37 °C.</li>
		<li>Antes dos experimentos de injeção, colher uma bola de cardiomiócitos de cada poço por aspiração com o meio de cultura usando uma pipeta de 1.000 μL e coletá-la em um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Coloração com PKH26 seguindo as instruções do fabricante para rastreamento após a enxertia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparações para o método de injeção lenta
<ol><li>Preparação da solução-mãe de gelatina<ol><li>Pesar a gelatina, dissolvê-la em tampão Ads para produzir uma solução a 10% p/v e autoclavá-la.</li>
	</ol></li>
	<li>Produção de um dispositivo de injeção de células<ol><li>Projeto geral do dispositivo: Prepare o aparelho mostrado na Figura 1. Este sistema é combinado com um aparelho de resfriamento de seringa e um aparelho de injeção principal.</li>
		<li>Preparar o aparelho de injeção principal descrito abaixo:<ol><li>Para uma injeção neonatal de bola de cardiomiócitos, use uma agulha de 29 G, 50 mm de comprimento equipada com uma seringa.</li>
			<li>Conecte uma seringa de transferência de energia (18G, 1 mL) consecutivamente usando uma seringa de injeção de células (Figura 1). Conecte a agulha da seringa de transferência de energia a um tubo fino de polipropileno com baixa capacidade de expansão do lúmen.</li>
			<li>Em seguida, conecte o outro lado do tubo de transferência de energia à agulha da mesma seringa (18G, 1 mL) e coloque-a em uma bomba de seringa. Encha as duas seringas e tubos de transferência de energia com água sem bolhas de ar. NOTA: Quando um êmbolo da seringa de transferência de energia é empurrado, a pressão é transferida diretamente para a outra seringa e o êmbolo se projeta.</li>
		</ol></li>
		<li>Configure o sistema de resfriamento da seringa de injeção conforme descrito abaixo.<ol><li>Enrolar firmemente um tubo de cobre (diâmetro externo = 1 mm; diâmetro interno = 0,3 mm; espessura = 0,35 mm) firmemente ao redor da parte que contém a célula da seringa de injeção celular, deixando 10 mm de excesso de tubo em ambas as extremidades.</li>
			<li>Conecte o tubo de cobre a tubos plásticos flexíveis. Além disso, conecte as outras extremidades da tubulação plástica a uma bomba externa, encha a linha com água de resfriamento e resfrie a água imergindo o excesso do tubo de cobre em gelo triturado (Figura 1). NOTA: Este sistema de arrefecimento mantém a solução de suspensão celular no cilindro a aproximadamente 2 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Desenvolvimento de um modelo de infarto do miocárdio em ratos por oclusão obtusa da artéria coronária
<ol><li>Anestesiar ratos machos imunodeficientes nus (F344/Njcl-rnu/rnu) com ar contendo isoflurano a 3%. Insira uma cânula na traqueia e conecte-a ao respirador.</li>
	<li>Conecte uma cânula a um vaporizador de isoflurano com um controlador para manter uma concentração de isoflurano a 3% e, assim, manter anestesia suficiente. Confirme que não houve resposta a estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa cirúrgica aquecida a 40 °C. Torcer o corpo do rato à direita do eixo do corpo e usar a axila esquerda como campo cirúrgico.</li>
	<li>Retire os pelos no campo cirúrgico usando um creme depilatório e limpe a pele com iodopovidona. Usando tesoura afiada, corte uma incisão de 1,5 cm na pele e no músculo peitoral maior.</li>
	<li>Confirmar o terceiro espaço intercostal e rasgar os músculos intercostais e a pleura costal usando micropinças com pontas rombas. Mantenha o peito aberto usando um afastador. Remova suavemente o pericárdio fino com pinças.</li>
	<li>Para construir um modelo de infarto da parede lateral do coração, encontrar a posição 1 mm caudal à ponta do átrio esquerdo para identificar a artéria coronária obtusa, passar uma sutura de seda 7-0, colher tecido com 2,5 mm de largura e 2,5 mm de profundidade do dorsal para ventral e ligar o tecido firmemente.</li>
	<li>Confirmar o sucesso da ligadura pela contração fraca distal da ligadura. Após a remoção suave do afastador, colocar um fio de seda 5-0 entre o segundo e o quarto espaços intercostais e fechar a toracotomia.</li>
	<li>Diminuir a concentração de isoflurano para 1%. Suture suavemente o músculo e a pele com seda 5-0. Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que a respiração espontânea comece.</li>
	<li>Aplicar topicamente 2 mg/mL de lidocaína em soro fisiológico na incisão. Administrar 1 ml de solução salina por injeção subcutânea. Aplique pomada veterinária topicamente para prevenir infecções.</li>
	<li>Retirar o rato do tubo de intubação e retornar à gaiola do animal; Em seguida, levante os ratos em gaiolas individuais por 1 semana.</li>
	<li>Analisar as alterações na função da bomba sistólica cardíaca por meio da ecocardiografia. NOTA: A função cardíaca estará reduzida devido ao infarto do miocárdio lateral.</li>
</ol>4. Transplante de células percutâneas ecoguiado pelo método de injeção lenta
<ol><li>Pré-aqueça o caldo de gelatina a 10% a 37 °C até ficar líquido.</li>
	<li>Diluir o caldo de gelatina a 10% com tampão Ads pré-aquecido para obter a solução final injetável de gelatina a 5% p/v (são necessários 100 μL por animal).</li>
	<li>Suspender 96 bolas de cardiomiócitos (total: 28.800 cardiomiócitos/animal) em 100 μL de solução injetável pré-aquecida.</li>
	<li>Carregar a suspensão preparada na etapa 4.3 na seringa de injeção celular, evitando a aspiração do excesso de ar.</li>
	<li>Para eliminar bolhas na seringa, segure-a verticalmente com a agulha para cima, bata na seringa e colete quaisquer bolhas na crista superior da seringa. NOTA: Durante esta etapa, observe as bolas de cardiomiócitos gradualmente se acomodarem no selo de borracha do êmbolo.</li>
	<li>Mantenha a posição vertical da seringa, empurre o êmbolo lentamente e elimine as bolhas e o excesso de solução de suspensão celular até que 20 μL da suspensão celular permaneçam na seringa. Empurre o êmbolo cuidadosamente a uma velocidade constante para que a bola de cardiomiócito permaneça apoiada na vedação de borracha do êmbolo.</li>
	<li>Mergulhe a seringa tampada diretamente em um banho de gelo por 5 min.</li>
	<li>Coloque uma seringa resfriada no aparelho de injeção. Fixe firmemente o aparelho da seringa de injeção instalado em um dispositivo de movimento fino no palco do animal usando uma braçadeira artesanal ajustável em posição X-Y-Z. O dispositivo de movimento fino pode mover a posição da agulha usando os movimentos de deslizamento de 20 mm na direção x, balanço na direção y e curvamento na direção z.</li>
	<li>Anestesiar os ratos em uma caixa selada cheia de ar contendo isoflurano a 3%. Confirmar a anestesia sem resposta aos estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa de eco aquecida a 40 °C. Para manter anestesia suficiente, certifique-se de que o ar inalado contenha uma concentração de aproximadamente 3% de isoflurano.</li>
	<li>Retire o cabelo no campo de injeção (2 cm de diâmetro) e o peito com creme depilatório e limpe a pele com iodopovidona.</li>
	<li>Aplicar eco-gel no tórax e sonda de eco. Colocar o ecoprobe próximo ao tórax ao longo dos eixos cranial e caudal e iniciar a obtenção da ecocardiografia modo B seguindo o manual do fabricante.</li>
	<li>Avançar a ponta da agulha de injeção para o miocárdio na vista frontal (Figura 2 e Vídeo Suplementar 1).</li>
	<li>Para ativar a bomba de seringa principal, pressione o botão Iniciar e gire o mostrador para ajustar a um número predeterminado para uma velocidade de injeção de aproximadamente 0,02 μL/s. Aplique pomada veterinária topicamente ao redor da posição do agulhamento para evitar infecções. NOTA: É necessário determinar o número de marcação adequado para a velocidade de injeção pretendida utilizando uma solução de injeção. Após a injeção, remova a agulha de injeção usando um sistema de movimento exemplar.</li>
	<li>Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que o animal recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.</li>
</ol>5. Avaliação da função cardíaca
<ol><li>Anestesiar os ratos em uma caixa selada cheia de ar contendo isoflurano a 3%. Confirmar a anestesia sem resposta aos estímulos dolorosos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Aplique creme eletrizante para aquisição de ECG nas pontas dos membros. Fixar os membros com fitas cirúrgicas cortadas em uma placa de eco aquecida a 40 °C. Use um sistema de monitoramento fisiológico para detectar ECG em tempo real e frequência cardíaca.</li>
	<li>De acordo com as instruções do fabricante, primeiro determine o ângulo do eixo longo usando a imagem de eco modo B mostrando o ápice do ventrículo esquerdo para a via de saída e, em seguida, gire o ecoprobe 90° para mudar para o corte de eixo curto.</li>
	<li>Usando apenas o sistema de movimento fino do eixo caudal para rostral do estágio animal, ajuste a visão de eixo curto para o nível do músculo papilar. Em seguida, altere o modo de imagem para o modo M pressionando o botão M-mode e grave um vídeo por 5 s pressionando o botão Cine-loop.</li>
	<li>Para analisar e calcular o encurtamento da fração usando o software, pressione o botão Medir e uma ferramenta de linha vertical para definir as dimensões internas sistólicas e diastólicas finais do ventrículo esquerdo. O software calcula automaticamente a porcentagem de encurtamento da fração (FS).</li>
	<li>Diminuir a concentração de isoflurano para 0% e aguardar aproximadamente 5 min até que o animal recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.</li>
</ol>6. Imuno-histoquímica
<ol><li>Fixar o corpo eutanasiado (realizar a eutanásia como no passo 1.1.3) sobre a mesa usando as fitas cirúrgicas cortadas, excisar os corações, lavar com PBS e imergir o coração em paraformaldeído/PBS a 4%.</li>
	<li>Disseque os corações em três seções, mergulhe-os em sacarose a 40% para crioproteção, embuta em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele-os a -80 °C.</li>
	<li>Fixar os tecidos criosseccionados (8 μm de espessura) a lâminas de vidro revestidas com aminosilano. Após secagem suficiente usando vento não aquecido gerado por um secador de cabelo geral, mergulhe as lâminas de vidro em solução salina tamponada com tris, contendo 0,2% de Tween-20 (TBS-T).</li>
	<li>Mergulhá-los numa solução de bloqueio durante 30 minutos a 25 °C. Despeje 100 μL da solução de bloqueio contendo anticorpos primários na lâmina e incube durante a noite a 4 °C com selamento em parafina para manter a solução de anticorpos espalhada no tecido. NOTA: A concentração de anticorpos é mostrada na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Coloque as lâminas horizontalmente em uma caixa artesanal de alta umidade utilizando o vapor natural do papel molhado para evitar a evaporação. Lave as lâminas três vezes com TBS-T.</li>
	<li>Tratar com o agente bloqueador secundário contendo anticorpos durante 1 h a 25 °C da mesma forma que o anticorpo primário. Após três lavagens, observar os sinais de fluorescência utilizando microscópio de fluorescência e microscópio confocal a laser. NOTA: A concentração de anticorpos é mostrada na Tabela de Materiais.</li>
	<li>Análise estatística: Para a comparação do volume celular, como mostra a Figura 3A, realizar o teste t não pareado; para avaliar a recuperação funcional cardíaca após a administração de cardiomiócitos pelo método de injeção lenta, como mostrado na Figura 4A, use um teste t pareado. Neste trabalho, as diferenças foram consideradas estatisticamente significantes a partir de P <,01. As barras de erro representam o desvio padrão.</li>
</ol>

Um novo método de injeção lenta minimamente invasivo para reduzir a lesão tecidual

<ol>
	<li>Chavkin, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+surface+receptors+Ror1/2+control+cardiac+myofibroblast+differentiation.">The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+membrane+repair+protein+MG53+modulates+transcription+factor+NF-&#954;B+signaling+to+control+kidney+fibrosis.">The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-&#954;B signaling to control kidney fibrosis.</a> Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).</li><li>Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. 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O autor não tem nada a revelar.

Um dos pontos críticos no desempenho bem-sucedido do método de injeção lenta é a preparação de um sistema de injeção eficaz usando uma bomba de seringa poderosa e um tubo de transferência de pressão forte. Um sistema de alta pressão é necessário para empurrar o gel para fora da ponta de uma agulha fina. O segundo ponto crítico é a estabilização do coração. O batimento do coração contra uma agulha de injeção avançada no miocárdio pode ferir o tecido. Neste estudo, uma injeção ecoguiada foi conduzida para evitar que os animais sofressem uma segunda lesão torácica aberta e para administrar a injeção de células em um coração estabilizado com os pulmões inflados. Além disso, em algumas aplicações para animais maiores ou humanos, alguns dispositivos de injeção conectados ao coração devem ser considerados como parte do design estratégico da aplicação. Para injeções torácicas abertas no coração de pequenos animais, recomenda-se o uso de uma agulha longa e flexível, dadas as frequências cardíacas mais altas.
Neste trabalho, o método de injeção lenta aumentou significativamente o volume de cardiomiócitos sobrevivente em comparação com o método de injeção normal. A injeção normal causa dano celular via tensão de cisalhamento15. Em contraste, o método de injeção lenta não causa esse estresse teoricamente porque usa uma solução não newtoniana além da injeção lenta.
Em termos de fibrose local, o espaço intersticial ao redor dos cardiomiócitos sobreviventes normalmente injetados mostrou forte e disseminada deposição de colágeno tipo I. Em contraste, os sinais de colágeno tipo I ao redor dos cardiomiócitos enxertados pelo método de injeção lenta foram muito mais fracos e limitados. Isso sugere que o método de injeção lenta causou significativamente menos danos. A injeção lenta de cardiomiócitos neonatais no miocárdio adulto melhorou significativamente a função contrátil do coração infartado. As análises histológicas sugeriram que a enxertia dos cardiomiócitos pelo método de injeção lenta resultou em conexões diretas e acoplamento funcional com os cardiomiócitos do hospedeiro. Esse fenômeno explica o mecanismo de recuperação funcional do miocárdio do hospedeiro. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de cardiomiócitos neonatais enxertados com conexões contínuas em larga escala com os cardiomiócitos adultos do hospedeiro. As conexões funcionais com o miocárdio do hospedeiro via acoplamento elétrico e mecânico podem fazer com que os cardiomiócitos enxertados amadureçam e permitam que eles atuem como miócitos funcionais que contribuem para a função cardíaca do hospedeiro. Interações de força física em longo prazo entre o hospedeiro e os cardiomiócitos do enxerto são cruciais para a maturação completa. Portanto, 2 meses após a injeção podem ser necessários para a recuperação funcional do coração infartado. A recuperação tempo-dependente da função cardíaca do paciente pode ser um fenômeno esperado em aplicações terapêuticas, e isso pode ser uma marca do estabelecimento bem-sucedido do acoplamento funcional de novo e da integração entre o hospedeiro e os cardiomiócitos enxertados.
O método de injeção lenta pode ser realizado durante a cirurgia torácica aberta. Além disso, esse método pode ser aplicado em camundongos. Para futuras aplicações em terapia humana, ainda precisamos resolver várias questões. A velocidade de injeção deve ser otimizada considerando-se a capacidade tampão do fluxo de fluido intersticial em cada órgão-alvo humano. Devem ser aplicados materiais livres de xeno, como gelatina humana ou materiais sintéticos biodegradáveis. Devem ser desenvolvidos aparelhos clínicos de injecção lenta de grau GMP, tais como ferramentas descartáveis compactas específicas para órgãos ou um aparelho reutilizável aplicável a órgãos largos.

A administração e a substituição celular são novas estratégias terapêuticas promissoras para órgãos fortemente lesados. Dentre essas novas estratégias terapêuticas, a medicina regenerativa cardíaca tem atraído considerável atenção. Entretanto, a inflamação causada por lesões medeia a formação de cicatrizes em vários órgãos1,2,3,4. O coração humano é composto por aproximadamente 10a 10 cardiomiócitos; portanto, teoricamente5,6, deve ser tratada com mais de 10a 9 cardiomiócitos. A administração de um grande número de cardiomiócitos pelos métodos tradicionais de injeção pode levar a lesões teciduais significativas7. Este método fornece um novo método de injeção celular com mínima invasão tecidual.
A administração de células no parênquima do órgão requer injeção(ões). No entanto, existe uma discrepância na medida em que a própria injeção pode levar a lesão tecidual. A lesão tecidual causa inflamação local e cicatrizes incuráveis em órgãos e tecidos, além de comprometimento da capacidade regenerativa 8,9,10. O coração de mamíferos tem uma propensão extremamente alta a desenvolver cicatrizes ao invés de se regenerar, pois requer reparo imediato da lesão para suportar a pressão arterial elevada causada por sua função de bombeamento contínuo11. A terapia de ablação utiliza essa alta propensão à formação de cicatrizes e bloqueia o circuito que provavelmente sofrerá formação de cicatriz usando arritmia12. Em estudo anterior, observou-se que o tecido cicatricial isolou os cardiomiócitos injetados no miocárdio do hospedeiro. Assim, este representa o próximo problema alvo que precisa ser superado para se obter melhor eficácia terapêutica na medicina regenerativa cardíaca.
O fluxo de fluido intersticial tecidual desempenha um papel vital no transporte de oxigênio e nutrientes para as células e na remoção dos resíduos excretados das células. A velocidade fisiológica do fluxo de fluido intersticial em cada tecido/órgão é diferente (a faixa é de 0,01-10 μm/s)13. Até onde o autor sabe, não há dados sobre a capacidade de tecidos/órgãos individuais suportarem quantidades extras de líquido sem edema patológico; No entanto, este experimento tenta usar uma velocidade de injeção lenta para possivelmente reduzir a lesão tecidual, e os resultados podem ser usados para determinar a praticidade desse conceito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needle &#38; tuberculin, 1 mL</td>
			<td>Terumo&#160;</td>
			<td>NN1838R, SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29-gauge 50 mm-long needle</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>14903 Type-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A copper tube</td>
			<td>General Suppliers</td>
			<td></td>
			<td>outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ads Buffer</td>
			<td>Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-MEM</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>051-07615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14695-1-AP</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6219</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>using dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking solution (Blocking One)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>03953-95&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal laser microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest, FL, USA</td>
			<td>S1820-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine movement device (Micromanipulator)</td>
			<td>Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>M-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon Instruments, Tokyo, Japan</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9382</td>
			<td>dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats</td>
			<td>Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>0&#8211;2 d after birth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-adhesive 96-well plates (spheloid plate)</td>
			<td>Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-0096S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound&#160;</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA</td>
			<td>Tissue-Tek OCT compound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (for cooling system)</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>SMP-23AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2</td>
			<td>Chemglass life sciences LLC, NJ, USA</td>
			<td>CG-2003-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe&#160;</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-N25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump with remote controller</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>MR-1, CT-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine methyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>215240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>167-11515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>veterinarian ointment</td>
			<td>&#160;Fujita Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>Hibikusu ointment&#160; #WAK-95832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weakly curved needle with ophthalmic thread</td>
			<td>Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>C7-70</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel cell injection method with minimum invasion

A injeção direta de células nos tecidos é um processo necessário na administração e/ou terapia de reposição celular. A injeção de células requer uma quantidade suficiente de solução de suspensão para permitir que as células entrem no tecido. O volume da solução de suspensão afeta o tecido, e isso pode causar lesão invasiva importante como resultado da injeção de células. Este trabalho relata um novo método de injeção celular, denominado injeção lenta, que visa evitar essa lesão. No entanto, empurrar as células para fora da ponta da agulha requer uma velocidade de injeção suficientemente alta de acordo com a lei de Newton da força de cisalhamento. Para resolver a contradição acima, um fluido não newtoniano, como solução de gelatina, foi utilizado como solução de suspensão celular neste trabalho. A solução de gelatina tem sensibilidade à temperatura, pois sua forma muda de gel para sol a aproximadamente 20 °C. Portanto, para manter a solução de suspensão celular na forma de gel, a seringa foi mantida resfriada nesse protocolo; No entanto, uma vez que a solução foi injetada no corpo, a temperatura corporal converteu-a em um sol. O fluxo de fluido tecidual intersticial pode absorver o excesso de solução. Neste trabalho, a técnica de injeção lenta permitiu que bolas de cardiomiócitos entrassem no miocárdio do hospedeiro e enxertassem sem fibrose circunjacente. Este estudo empregou um método de injeção lenta para injetar cardiomiócitos neonatais de ratos purificados e formados por bola em uma área remota de infarto do miocárdio no coração de ratos adultos. Aos 2 meses após a injeção, os corações dos grupos transplantados apresentaram melhora significativa da função contrátil. Além disso, a análise histológica dos corações injetados lentamente revelou conexões perfeitas entre o hospedeiro e os cardiomiócitos do enxerto através de discos intercalados contendo conexões de junções comunicantes. Este método poderia contribuir para terapias celulares de próxima geração, particularmente na medicina regenerativa cardíaca.

Cell administration and replacement are promising novel therapeutic strategies for heavily damaged organs. Among these novel therapeutic strategies, cardiac regenerative medicine has attracted considerable attention. However, the inflammation caused by injuries mediates scar formation in several organs1,2,3,4. The human heart consists of approximately 1010 cardiomyocytes; therefore, theoretically5,6, it must be treated with more than 109 cardiomyocytes. Administering a large number of cardiomyocytes via traditional injection methods may lead to significant tissue injuries7. This method provides a novel cell injection method with minimal tissue invasion.
Cell administration into the organ parenchyma requires injection(s). However, a discrepancy exists in that the injection itself may lead to tissue injury. Tissue injury causes local inflammation and incurable scarring in organs and tissues, as well as impaired regenerative ability8,9,10. The mammalian heart has an extremely high propensity to develop scars instead of regenerating because it requires immediate injury repair in order to endure the high blood pressure caused by its continuous pumping function11. Ablation therapy utilizes this high propensity toward scar formation and blocks the circuit likely to undergo scar formation using arrhythmia12. In a previous study, it was observed that the scar tissue isolated the injected cardiomyocytes in the host myocardium. Thus, this represents the next target issue that needs to be overcome to obtain improved therapeutic efficacy in cardiac regenerative medicine.
Tissue interstitial fluid flow plays a vital role in conveying oxygen and nutrients to cells and removing the excreted waste from cells. The physiological speed of interstitial fluid flow in each tissue/organ is different (the range is 0.01-10 &#181;m/s)13. To the best of the author&#39;s knowledge, there are no data regarding the capacity of individual tissues/organs to support extra amounts of fluid without pathological edema; however, this experiment attempts to use a slow injection speed to possibly reduce tissue injury, and the results can be used to determine the practicality of this concept.

Autor em destaque: um novo método de injeção de células com invasão mínima  

Um novo método de injeção de células com invasão mínima

In this work, the purpose is to improve the efficacy of regenerative medicines, especially heart regenerative medicine using induced pluripotent stem cells. Heart regenerative medicine is our most contributed research field. My significant findings include a metabolic selection of cardiomyocytes, i.e.a simple and mass purification mass way for cardiomyocytes with cultural condition of withdrawn glucose and added lactate. Another finding includes the efficient engraftment method for cardiomyocytes by publication of cardiomyocyte poles. This transplantation method with cardiomyocyte poles confirmed the enhanced engraftments of cardiomyocyte poles.However, the lack of direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was found. This technique offers fewer invasions to the tissues receiving the cell injections. As a result of this, direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was facilitated.This technology can diminish injuries, inflammatory responses, and eventually fibrosis, i.e. scar formation. Hopefully, this technology will be applied to the next generation of regenerative medicines, including heart regenerative medicine using pluripotent stem cells.We have already found several ways to bring significant merit to heart regenerative medicine. These studies will be continued in the future.

Efeitos da injeção lenta na sobrevivência celular e deposição de colágeno Bolas de cardiomiócitos neonatais marcadas com PKH26 foram injetadas no miocárdio de ratos nude normal usando um método de injeção normal ou lenta. Os resultados mostraram que o método de injeção lenta aumentou significativamente o volume celular enxertado (Figura 3A) e diminuiu significativamente a deposição de colágeno tipo I no local (Figura 3B).
Efeitos da injeção lenta na eficácia do tratamento em modelo de infarto em ratos O método de injeção lenta guiada por ecocardiógrafo foi usado para injetar bolas de cardiomiócitos neonatais de ratos ou PBS(−) nos corações infartados de ratos modelo. O grupo injetado apenas com células apresentou melhora significativa na função de contração cardíaca após 2 meses (Figura 4A). A análise imuno-histoquímica revelou uma conexão perfeita entre as células enxertadas e os miócitos do hospedeiro através de discos intercalados contendo junções comunicantes (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de todo o sistema de injeção . (A) Aparelho de injeção principal. (B) Sistema de resfriamento da seringa de injeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig02.jpg"> Figura 2: Injeção percutânea lenta guiada por ecocardiograma . (A) Fixação do animal, sonda de eco e aparelho de injeção. (B) Visão ecocardiográfica da seringa injetora e do coração. Observe que as figuras esquerda e direita são as mesmas, mas uma linha amarela foi adicionada para indicar a posição da agulha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig03.jpg"> Figura 3: Efeito do método de injeção lenta sobre o volume celular enxertado e deposição de colágeno. (A) Os volumes celulares enxertados (N = 3) foram calculados a partir de cortes seriados. As barras de erro indicam desvios padrão. *P < 0,01 no teste t não pareado. (B) Coloração imunoistoquímica para colágeno tipo I. A barra de escala indica 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig04.jpg"> Figura 4: Melhora da função cardíaca e integração histológica com bolas de cardiomiócitos enxertadas pelo método de injeção lenta . (A) Incidências representativas do ecocardiógrafo modo M. O gráfico mostra a transição dos encurtamentos fracionários no grupo transplantado com bola de cardiomiócitos (linha vermelha sólida; N = 4) e grupo veículo (solução de suspensão celular para o método de injeção lenta) (linha azul pontilhada; N = 3). Abreviações: IM = infarto do miocárdio; Cx43 = conexina 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PKH26 = marcação da membrana de células fluorescentes vermelhas. As barras de erro indicam os desvios padrão. *P < 0,01 no teste t pareado. (B) Análise imunoistoquímica da relação entre as bolas de cardiomiócitos enxertadas e os cardiomiócitos do hospedeiro. As observações microscópicas convencionais do laser usando uma lente objetiva 2x são mostradas na coluna da esquerda. Versões ampliadas (usando uma lente objetiva de 20x) de duas áreas mostradas na caixa, rotuladas com * e #, são apresentadas abaixo. Barras de escala: imagem superior = 300 μm; * e # = 30 μm. Imagens microscópicas confocais a laser usando uma lente objetiva de 20x são mostradas ao longo do comaparison. Três posições são mostradas. Nas imagens mescladas, as pontas de seta indicam a existência de junções comunicantes (Cx43) conectando diretamente o enxerto e os cardiomiócitos do hospedeiro. A barra de escala indica 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo Suplementar 1: Método de injeção lenta ecoguiada. O ecocardiograma modo B na incidência frontal mostra a ponta da agulha de injeção avançada para o miocárdio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/Supplementary%20video.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Este método elimina qualquer invasão importante durante as injeções celulares causadas pela solução de suspensão celular.

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

Neste trabalho, o objetivo é melhorar a eficácia de medicamentos regenerativos, especialmente a medicina regenerativa cardíaca usando células-tronco pluripotentes induzidas. A medicina regenerativa do coração é o nosso campo de pesquisa mais contribuinte. Meus achados significativos incluem uma seleção metabólica de cardiomiócitos, ou seja,Forma de purificação de massa simples e em massa para cardiomiócitos com condição cultural de glicose retirada e adição de lactato. Outro achado inclui o eficiente método de enxertia de cardiomiócitos pela publicação de polos de cardiomiócitos. Esse método de transplante com polos de cardiomiócitos confirmou o aumento dos enxertos de polos de cardiomiócitos.Entretanto, foi encontrada a falta de interação direta entre o hospedeiro e os cardiomiócitos do enxerto. Essa técnica oferece menos invasões aos tecidos que recebem as injeções celulares. Com isso, a interação direta entre o hospedeiro e os cardiomiócitos do enxerto foi facilitada.Essa tecnologia pode diminuir lesões, respostas inflamatórias e, eventualmente, fibrose, ou seja, formação de cicatrizes. Espera-se que essa tecnologia seja aplicada à próxima geração de medicamentos regenerativos, incluindo a medicina regenerativa cardíaca usando células-tronco pluripotentes.Já encontramos várias maneiras de trazer mérito significativo para a medicina regenerativa do coração. Esses estudos serão continuados no futuro.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

837 visualizações.  Kansai Medical University. Neste trabalho, o objetivo é melhorar a eficácia de medicamentos regenerativos, especialmente a medicina regenerativa cardíaca usando células-tronco pluripotentes induzidas. A medicina regenerativa do coração é o nosso campo de pesquisa mais contribuinte. Meus achados significativos incluem uma seleção metabólica de cardiomiócitos, ou seja,Forma de purificação de massa simples e em massa para cardiomiócitos com condição cultural de glicose retirada e adição de lactato...

Vídeo: Autor em destaque: um novo método de injeção de células com invasão mínima  

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Bioengenharia

Preparation of the Neonatal Rat Cardiomyocyte Balls for the Slow Injection Method

Begin by measuring the neonatal Rat Ventricular Cardiomyocytes concentration using a hemocytometer. Dilute the cell suspension solution to 3, 000 cells per milliliter, with alpha MEM containing 10%heat inactivated FBS. Distribute 100 microliters of the diluted ventricular cardiomyocyte in each well of the cell's non-adhesive 96 well plates.Centrifuge the cells for five minutes at 100 G.And culture them for two to three days in the cell culture incubator, with 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. After incubation, aspirate the culture medium from the Rat Cardiomyocyte balls seeded in the non-adhesive 96 well plate. Then, transfer the cardiomyocyte balls from each well to a 15 milliliter tube.Centrifuge the cardiomyocyte balls and aspirate the supernatant. Then, wash them using an ADS buffer. To facilitate the tracking of the cardiomyocyte cells in the Rat after engraftment, stain the cells with PKH26.Before centrifuging the cells, track the development of bidim cardiomyocyte balls by observing them under the microscope regularly after seeding. Begin preparing the main injection apparatus for a neonatal cardiomyocyte ball injection using a 29 gauge, 50 millimeter long needle equipped with a syringe. Connect an 18 gauge one milliliter power transfer syringe needle to a thin polypropylene tube with low lumen expandability.Aspirate the water using a syringe, and remove all the bubbles from the syringe and the connected tubes. Repeat it for another 18 gauge needle. Then, connect the other side of the power transfer tube to the 18 gauge needle of the same one milliliter syringe.Confirm the successful power transition by pushing one syringe plunger down, and another syringe plunger up. Once done, set the syringe in a syringe pump. Next, set up the cooling system by attaching the tightly coiled copper tube to the cell containing part of the cell injection syringe.Leaving 10 millimeter of excess pipe at both ends. Connect the copper tube to the flexible plastic tubing before connecting the other ends of the plastic tubing to an external pump. Fill the line with cooling water, and immerse the excess copper tube into crushed ice to cool the water.This cooling system maintains the cell suspension solution in the cylinder at approximately 2 degrees Celsius.

Preparo das bolas de cardiomiócitos neonatais de ratos pelo método de injeção lenta

Preparation of Cardiomyocytes and Setting-Up the Apparatus for the Slow Injection Method

Prepare the 10%gelatin stock solution by weighing and dissolving the gelatin in the ADS buffer, and autoclaving the solution. Rewarm the 10%gelatin stock at 37 degrees Celsius, until it becomes liquid. Then dilute the gelatin stock, using a prewarmed ADS buffer, to obtain the final injectable 5%gelatin solution.Suspend 96 cardiomyocyte balls in 100 microliters of prewarmed injection solution. Load the cardiomyocyte ball suspension into the cell injection syringe without aspirating the excess air. Next, hold the syringe vertically, with the needle facing upward, and tap the syringe to collect the bubbles at the upper ridge of the syringe.Also, observe the cardiomyocyte balls gradually settling onto the rubber seal of the plunger. Maintain the vertical position of the syringe, and slowly push the plunger to discard the bubbles and excess cell suspension solution, until 20 microliters of the cell suspension remain in the syringe, and the cardiomyocyte ball remains resting on the rubber seal of the plunger. Once done, immerse the capped syringe in an ice bath for five minutes, and fix the injection syringe apparatus on the animal stage before activating the main syringe pump during percutaneous cell transplantation in an anesthetized rat.