Agradecemos ao Instituto Magdi Yacoub (MYI) para apoiar a análise de microscopia e os projetos que envolvem a reparação cardíaca, os técnicos eo Gerente de nossa unidade animal. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Britânica do Coração (BHF), concessão Projeto PG/10/019. MPS é suportado pelo MYI e BHF. TP é um BHF-Research Excellence Fellow. NR é um NH &amp; MRC Austrália Fellow.

Todos os estudos com animais foram realizados em conformidade com as normas internacionais (Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu) e nacional (UK Home Office, Act 1986) regulamentos. Os procedimentos descritos neste documento fazem parte do nosso plano de trabalho sob licença autoridades do Reino Unido e que não tenham sido realizadas com a finalidade de gravação. 1. Preparação de Células Este protocolo descreve a preparação de uma linha celular específica (rim embrionário humano, células HEK293) para fins de demonstração. Protocolos específicos de células deve ser empregue para o cultivo e, eventualmente, diferenciando pluripotentes ou células estaminais adultas em linhagens celulares específicas. <ol><li> Cultivar células em meio DMEM (glucose elevada, 4,500 mg / L) contendo piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina, 1% de antibiótico de Pen / Strep e 10% de soro fetal bovino (FBS). Uma placa de 10 centímetros deve ser normalmente dividida em 1:03 e meio suplementado fresco a cada dois dias. </li><li> Trate células levemente com Trypsem 1x e ressuspender em meio DMEM, como descrito em 1.1. </li><li> Contar as células numa câmara hemocitómetro e recolher 3 x 10 6 células para um tubo separado. </li><li> Centrifugar em um balanço balde rotor a 100 g por 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento de células com tampão de fosfato estéril 2x. </li><li> Ressuspender em PBS 1x a uma concentração de 10 6/50 ^ para ser injectada no ventrículo esquerdo de ratos Imunodeprimido. </li></ol> 2. Condições pré-cirúrgicas <ol><li> Manter camundongos Imunodeprimido (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) com grânulos estéreis de alimentos e água em um isolador de temperatura controlada (22 ° C; Tabela 1) antes de cada cirurgia. </li><li> Realizar a cirurgia de camundongos Imunodeprimido sob uma capela de fluxo laminar. Limpe a área de trabalho com 70% de etanol e autoclave instrumentos cirúrgicos (pinças e tesouras). </li><li> Ligue almofadas de aquecimento para a cirurgia e para a recuperação. Almofadas de aquecimento são importantespara bloquear a redução da temperatura corporal que ocorre durante e pós-cirurgia. </li><li> Coloque uma gaiola limpa e esterilizada no bloco de recuperação-aquecimento. </li><li> Transportar os ratos em suas gaiolas originais do isolador para a sala de cirurgia em uma bolsa estéril autoclavada. </li><li> Pesa-se o rato e de acordo com o peso corporal injectar por via subcutânea (sc) de uma solução contendo cloridrato de cetamina e medetomidina, diluída em solução salina estéril a 0,9%, para anestesiar o rato, assim como para relaxar a musculatura (medetomidina 1 mg / kg; cloridrato de cetamina 75 mg / kg). </li><li> Remover o rato da gaiola quando totalmente anestesiados (dentro de 1-2 min, nenhum reflexo toe-pitada após estimulação) </li><li> Aplicar creme de depilação no lado esquerdo do peito e da área da garganta. Depois de uma quantidade adequada de tempo (cerca de 2-5 min), limpe os cabelos soltos com um tecido molhado em água. </li><li> Posicione o mouse no painel de cirurgia em decúbito dorsal. A partir deponto de vista do cirurgião, a posição é vertical, cauda para baixo da cabeça para cima. </li><li> Injectar solução analgésica em 0,1-0,2 ug / g diluídos em solução salina estéril (buprenorfina) subcutaneamente no membro posterior e cobrir a área raspada com a solução de iodo povidona asséptica usando um aplicador com ponta de algodão. </li><li> Concentre-se o microscópio (objetiva 2.5X) na área da garganta. </li></ol> 3. Condições cirúrgicas <ol><li> Com uma tesoura sem corte fazer uma incisão na pele ventral mediana de cerca de 0,5-1 cm de comprimento um pouco abaixo da cartilagem cricóide. Separa-se a pele do tecido conjuntivo para visualizar as glândulas salivares. </li><li> Dividir as glândulas salivares em sua divisão de linha média naturais puxando simultaneamente cada parte para um lado com retrator peito pinça e magnético e expor a traquéia. </li><li> Puxar a língua suavemente para o lado a expor a laringe. Deslize o tubo de intubação com cuidado na traquéia. A ponta do tubo é visível através da l exibidoarynx e traquéia. Mais importante, se o tubo está no, mas não são claramente visíveis, é no esófago. Removê-lo e alterar a posição da ponta do tubo. </li><li> Conectar o tubo à máquina de ventilação. Defina o volume de curso a 200 mL e 150 AVC / min. Fixe o tubo de ventilação no painel cirurgia com uma fita. </li><li> Com uma tesoura sem corte e uma pinça, faça uma cauda vertical para cabeça 1 - a 1,5 cm da pele de longa incisão sobre a área do tórax esquerdo. </li><li> Solte a pele das camadas de tecido / musculares e conjuntivos as maiores e menores músculos peitorais sem fazer incisões. </li><li> Toracotomia entre as terceira e quarta costela como se segue: <ol><li> Perfurar a camada de músculo intercostal beliscando e arranhando com pequenas pinças arredondadas. </li><li> Uma vez que a camada de músculo intercostal é perfurado, coloque o afastador peito para abrir ao máximo a cavidade torácica. As partes superior e médio do ventrículo esquerdo (VE) com a sua orelha sobrejacente (átrio) sãoagora visível. </li></ol></li><li> Prepara-se uma seringa de precisão com as células. A seringa deve ser capaz de fornecer uma quantidade de volume de 10 ul de cada injecção. Lançar uma agulha G 30, com a ponta da seringa. </li><li> Fixar com fita adesiva uma pequena cânula de plástico (de um Introcan-W 20 L) em que a agulha, deixando exposta apenas 1 mm, incluindo a ponta aberta da agulha. Isto vai evitar que a agulha perfura a parede do ventrículo esquerdo e toda a injecção das células no interior da cavidade do ventrículo esquerdo. </li><li> Com a ajuda de um objetivo 5X, visualizar com este aumento, o ventrículo esquerdo e injetar as células na parede do ventrículo esquerdo em 5 locais diferentes (cada injeção vai entregar 10 ul para um total de 106 células injetadas). Se a injecção for bem sucedido, uma área branca e na ausência de grande retrolavagem das células será visível (se a injecção, não foi bem sucedida, o animal seriam excluídos da análise funcional). </li><li> Retire o afastador. Feche a parede torácica by juntando as duas nervuras separadas com dois pontos de sutura de seda 6-0. </li><li> Hidratar os músculos peitorais e pele com um cotonete embebido em PBS 1x e gentilmente colocou os músculos de volta para a posição original com a pinça. </li><li> Feche a pele com 3-4 pontos de sutura 6-0 seda. Suturar a incisão na garganta com 2-3 pontos para fechar a pele. </li><li> Injetar atipamezole (1 mg / kg de concentração final) para reverter os efeitos anestésicos. </li><li> Assim que o rato começa a respirar de forma autônoma, tirar o tubo da traquéia e coloque o mouse sobre o seu lado direito. O mouse deve se recuperar em poucos minutos. </li><li> Quando o rato começa a girar e andar, colocá-lo na gaiola de recuperação quente (gaiola pequena IVC com top filtrada fechado) por uma hora. </li><li> Deixar os animais durante a noite numa caixa aquecida controlada (37 ° C). </li><li> Encha um prato com água e alimentos pellet para apoiar a recuperação durante os primeiros 2 dias após a cirurgia. </li></ol> Dez corações injectados com células de controlo e 10 corações não injectados são analisados ​​histologicamente como se segue: <ol><li> Realizar a análise das células enxertadas de 1 semana após a injecção (Figuras 1 e 3). <ol><li> Após a eutanásia por overdose de isoflurano, perfuse os corações com 20 ml de paraformaldeído 4% (PFA) para fixar o tecido. Desidratar o tecido fixado em percentagens crescentes de etanol (70-100%) e incorporar em blocos de parafina. </li><li> Seção dos corações em parafina com um micrótomo a 5 mM e mancha com hematoxilina e eosina para análise morfológica. </li><li> Visualize tecido conjuntivo usando tricrômico de Masson. </li><li> Analisar as imagens em um microscópio scanner de slides (Figuras 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizar todo o coração em eixo curto usando um microscópio scanner de slides digitais (FiguRes. 1B e 1C). </li></ol></li><li> Após as análises acima, Retire a parafina os tecidos do coração em xileno, re-hidratados, submergindo as amostras em percentagens decrescentes de etanol (a partir de 100% de água) e um processo para a Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM), da seguinte forma: <ol><li> Incubar blocos desparafinadas com 1% de ácido tânico, em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. </li><li> Desidratar espécimes em percentagens crescentes de etanol (25-100%). </li><li> As amostras secas com HMDS (hexametildisilazano). </li><li> Monte os espécimes em Stubbs com Acheson Prata Dag e revesti-los com ouro-paládio. </li><li> Veja amostras em um microscópio eletrônico de varredura analítica (Figura 2B). </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, nós mostramos como realizar injeção intramiocárdica de células nos corações murinos. Como prova dessa metodologia, temos usado células HEK293. É importante ressaltar que as células HEK293 não são usados ​​em qualquer estudo de terapia celular e, portanto, as conclusões deste manuscrito não são apropriados para tradução direta para uma abordagem terapêutica. No entanto, o facto de as células HEK293 não são células contrácteis e não transdiferenciar em outros tipos de células...

Vários protocolos de entrega de células foram testados em modelos murinos e de ratazana de doenças cardiovasculares, com o objectivo de traduzir a eficiência, a eficácia e segurança deste procedimento experimental em pacientes humanos. Em pequenos corações de roedores, a entrega de células mostrou ser o método mais viável de fornecimento de células de 1,2, enquanto que no anterógrada coração de rato 3 e infusão de células 4 intracoronária retrógrado também pode ser usado. Ambos os métodos têm limitações e vantagens. Entrega celular por via intracoronária tem vantagens teóricas sobre injeção intramuscular direto em promover a disseminação de células mundial 3, mas também tem o risco de causar 3,5 embolia coronária. Limitações à entrega intramiocárdica estão associados a danos mecânicos, inflamação aguda e danos 6,7 miocárdio. Em humanos, as células para o reparo cardíaco são entregues pela injeção transmural através de um epicardial endocárdio ou cirúrgicoaproximar ou por via arterial intracoronária 8. Injeção por via transvascular é adequado em pacientes com infarto agudo do miocárdio e reperfundido, mas pode não ser possível em caso de oclusões totais ou fluxo de pobres dentro dos vasos do território efetuada 9. Injeção direta na parede ventricular por injeção transendocárdica ou transepicárdica é tecnicamente viável, dependendo do estado de saúde do paciente. De facto, tem sido demonstrado que esta técnica é segura 10,11, embora injectável transepicárdica é necessária uma cirurgia de peito aberto e para transendocárdica se aproxima de um mapeamento electrofisiológico para cada paciente é necessário diferenciar sítios de miocárdio isquémico ou cicatrizes viável 9. É importante ressaltar que em estudos de terapia celular a escolha do melhor celular para ser transplantado ainda está sob investigação. Análises de curto prazo (4 semanas) mostrou que a injeção de células-tronco cardíacas definidas como cardiospheres <saté&gt; 12 ou células população lado da medula óssea induzida 13 recuperação funcional cardíaca em murinos 14 e ratos 15 modelos de infarto do miocárdio, diminuindo o tamanho da cicatriz e morte celular. Transplante alogênico de cardiospheres em um modelo de infarto do miocárdio de ratos sem imunossupressão foi encontrado para ser seguro, promoveu a regeneração cardíaca, e melhora da função cardíaca através da estimulação dos mecanismos de reparação endógenas 15. Lin-/c-kit + adultos células progenitoras no coração mostraram-se auto-renovar, clonogénicas, e multipotentes in vitro e in vivo e, quando injectado num coração isquémico rato reconstituído grandes porções da parede do miocárdio lesionado e 16 tiveram o capacidade de formar artérias coronárias condutora e de tamanho intermediário 17. Estes dados promissores alimentado fase I e II de ensaios clínicos em seres humanos: A injeção de células-tronco mesenquimais autólogas e alogênicos (MSC) 18, 19 cardiospheres, ou células-tronco cardíacas positivas c-Kit (CSC) 20 nos corações humanos isquêmicos cada mostrou efeitos benéficos na função cardíaca em estudos a longo prazo. No entanto, extensivo a longo prazo de acompanhamento e retrospectiva meta-análise demonstrou que a terapia com células-tronco fornece benefício significativo para alguns pacientes, mas não em outros, com uma série de resultados imprevisíveis 21. É possível que essas limitações necessitará da criação de protocolos específicos de distribuição de célula para cada indivíduo e cada doença. Em modelos de ratos e ratos, estudos de longo prazo revelaram que a injeção de células não melhorar a função cardíaca (12 meses). Com efeito, os enxertos de células derivadas de cardiomiócitos estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas-CM) foram isoladas do hospedeiro do miocárdio por uma camada de tecido fibroso 22,23. Resultados similares foram observados após o transplante de mioblastos esqueléticos intramiocárdica no coração de ratos infartados 24. Furthermore, a capacidade de longo prazo de MSCs alogénicas para preservar a função do coração enfartado foi limitado por uma transição de um estado para immunoprivileged imunogénico após diferenciação 25. Levando em consideração os desafios e as perspectivas descritas acima, mostramos aqui como entregar as células pela injeção transmural em camundongos. Observamos que as células sem propriedades contráteis de cardiomiócitos não estão relacionadas com o miocárdio hospedeiro e formam uma massa coesa com uma barreira fibrótica fina. Embora, em alguns casos, este resultado pode ser vantajoso, a seguinte análise pode ser útil para compreender como enxerto de células pode ser modulado de modo a gerar estruturas miocárdio funcionalmente ligados bem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Estudos anteriores mostraram que a entrega de células promove a melhora da função cardíaca pela liberação de citocinas e fatores que aumentam a revascularização do tecido cardíaco e sobrevivência celular. Além disso, observações adicionais revelaram que as células estaminais específicos, tais como células estaminais cardíacas, células estaminais mesenquimais e cardiospheres têm a capacidade de integrar no interior do miocárdio circundante através da diferenciação em cardiomiócitos, células de músculo liso e células endoteliais. Aqui, apresentamos os materiais e métodos para entregar confiantemente células não contrátil na parede do ventrículo esquerdo de camundongos Imunodeprimido. Os passos mais salientes deste procedimento microcirúrgico envolve anestesia e analgesia injeção, intubação orotraqueal, a incisão para abrir o peito e expor o coração e entrega de células por uma agulha estéril de calibre 30 e uma seringa de precisão microlitro. Processamento de tecidos que consiste em colher coração, embedding, o seccionamento e a coloração histológicos mostraram que a injecção de células intramio produzido um pequeno dano na área do epicárdio, assim como na parede do ventrículo. Células não contrátil foram mantidas na parede do miocárdio de ratos imunocomprometidos e foram rodeados por uma camada de tecido fibroso, para o proteger de pressão cardíaca e carga mecânica.

Nós injectadas células HEK293, que são distinguíveis das células do coração pela sua morfologia diferente (Figura 1), com uma forma de paralelepípedos em comparação com os cardiomiócitos alongadas (Figura 1A). Células HEK293 foram mais reativas para corante hematoxilina (cor azul) em comparação com os cardiomiócitos (cor-de-rosa), provavelmente por causa de seu aumento do conteúdo nuclear (Figura 1A). Para além disso, distinguir as células injectadas a...

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

intramyocardial-cell-delivery-observations-in-murine-hearts

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K visualizações.  Imperial College London.  Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores. 

Vídeo: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicina

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Redução do Ventrículo Esquerdo de parede Estresse e Melhoria na função em falta Corações usando Algisyl-LVR

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Modelo murino de artéria femoral Injury fio com a implantação de uma droga patch Entrega perivascular

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Uma lesão de balão segmental controlada por pressão da artéria de rato com aplicação terapêutica periadventicional

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...