As agências de fomento FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC são reconhecidas pelos autores.

Todos os experimentos seguiram rigorosamente as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Brasília (processo 13364819.0.0000.5558), e as amostras foram identificadas por códigos para garantir o anonimato dos doadores. As células foram obtidas de doadores normais do sexo masculino, saudáveis, com idade entre 18 e 35 anos, que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e preencheram os seguintes critérios de elegibilidade: não fumantes/vapers, sem condições crônicas de saúde e sem história de condições inflamatórias nos últimos 14 dias.
1. Coleta de sangue
<ol><li>Coloque assepticamente 0,3 mL de 5.000 UI/mL de heparina (ver Tabela de Materiais) em uma seringa estéril de 20 mL para heparinizá-la.</li>
	<li>Aplicar um torniquete venoso cerca de 4 pontos acima do local da punção e identificar a veia cubital ou cefálica mediana para punção venosa. NOTA: Certifique-se de que o tempo total de torniquete não exceda 1 min.</li>
	<li>Limpar o local da punção com álcool a 70% e realizar a punção venosa.</li>
	<li>Inverta suavemente a seringa três ou quatro vezes depois de coletar o sangue para misturar o sangue e a heparina corretamente.</li>
</ol>2. Isolamento de neutrófilos
NOTA: Leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são isolados por centrifugação por gradiente de densidade seguido de lise hipotônica das hemácias remanescentes (RBC), como descritoanteriormente11 com algumas alterações. Este método não é obrigatório para a realização dos ensaios de triagem, podendo ser substituído desde que o método escolhido resulte em uma viabilidade de >97%, priming ou ativação de <3% dos PMNs, e produza células suficientes para todos os ensaios, réplicas e condições. A realização dessas etapas em condições assépticas e o uso de soluções livres de endotoxinas são mandatórios para evitar a ativação celular.
<ol><li>Fazer diluições de 12 mL de meios de separação de 60% e 70% (comercialmente disponíveis; ver Tabela de Materiais) em tubos cônicos de 50 mL.</li>
	<li>Prepare o gradiente de baixo para cima adicionando 4 mL de cada vez a diluição de 60% sobre a diluição de 70%, usando uma pipeta de 5 mL. Faça isso suavemente para evitar misturar a interface.</li>
	<li>Colocar cuidadosamente 12 mL de sangue heparinizado sobre o gradiente de densidade. Centrifugar a 200 x g durante 15 min à temperatura ambiente. OBS: A partir desta etapa, até a ativação do PMN, todos os reagentes e tubos utilizados devem ser mantidos em um resfriador cheio de gelo.</li>
	<li>Descarte a camada de plasma/células mononucleares e, em seguida, transfira suavemente a camada acima da pastilha de eritrócitos para dois tubos cônicos de 15 mL com aproximadamente 7,5 mL em cada. Completar o volume do tubo com solução salina balanceada de Hank (HBSS; ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.</li>
	<li>Lave o pellet de célula com HBSS.<ol><li>Descarte o sobrenadante despejando o tubo e ressuspenda suavemente o pellet em 7 mL de HBSS.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 19 °C para remover todos os meios de separação.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar lise hipotônica das hemácias remanescentes.<ol><li>Descarte o sobrenadante e combine os pellets em um único tubo.</li>
		<li>Ressuspender a pastilha de CH/PMN em 3 mL de H2O estéril e adicionar 3 mL de HBSS (2x) dentro de 25 s para restaurar a osmolaridade. Em seguida, centrifugar a 300 x g por 5 min a 19 °C.</li>
		<li>Repita os passos 2.8.1 e 2.8.2 para uma pastilha branca e sem eritrócitos. NOTA: O sobrenadante deve ser removido o mais rapidamente possível para minimizar o contacto dos neutrófilos com os produtos de degradação das hemácias. Alternativamente, a segunda lise hipotônica pode ser substituída ressuspendendo suavemente a camada residual de hemácias e removendo todo o sobrenadante, pois as hemácias restantes sedimentarão acima da pelota de PMN.</li>
	</ol></li>
	<li>Descarte o sobrenadante despejando o tubo, ressuspenda suavemente os PMNs no buffer restante e transfira-os para um microtubo gelado. NOTA: Certifique-se de anotar o volume durante a transferência das células ressuspensas com uma micropipeta.</li>
	<li>Transferir 3 x 1 μL da suspensão celular para uma lâmina de vidro limpa (três poços de 1 μL cada) e corar com panóptica rápida (ver Tabela de Materiais) para avaliação da morfologia e pureza12.<ol><li>Para coloração com panóptica rápida, imergir a lâmina cinco vezes no fixador panóptico n° 1, seis vezes em eosina n° 2 e duas vezes em hematoxilina n° 3, com duração de 1 s cada imersão.</li>
		<li>Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.</li>
		<li>Deixe escorrer e secar ao ar.</li>
	</ol></li>
	<li>Observar ao microscópio e contar 300 células aleatórias em cada poço, diferenciando os neutrófilos dos demais granulócitos.</li>
	<li>Transferir 1 μL da suspensão celular para 49 μL do corante azul de tripano a 0,2%13 e contar as células usando uma câmara de Neubauer, distinguindo entre células mortas e viáveis.</li>
	<li>Ajustar a concentração celular para 6.667 células/μL utilizando uma solução de plasma autólogo a 50% e HBSS a 50% suplementada com cálcio e magnésio. Dividir uniformemente a suspensão de 6.667 células/μL entre os microtubos correspondentes às condições a serem testadas, incluindo o controle negativo. NOTA: Qualquer concentração celular semelhante aos neutrófilos circulantes no organismo modelo pode ser usada, mas é importante usar a mesma concentração celular em todos os experimentos para reprodutibilidade.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65329/65329fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo de isolamento de neutrófilos. Duas concentrações do meio de separação (percoll) (A) são empilhadas (B), então o sangue é colocado em camadas no topo do gradiente de separação (C). Após a centrifugação, o PMN fica na camada central (D), que é dividida em dois tubos de 15 mL (E). A suspensão celular é lavada duas vezes em HBSS e centrifugada (G-I) para remover o meio, em seguida, as células são ressuspensas e as hemácias residuais são submetidas a duas rodadas de lise hipotônica (J-M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65329/65329fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Preparação para ativação de neutrófilos
<ol><li>Em microtubos de 1,5 mL, preparar um sistema de ativação para cada condição de modo que a concentração celular final seja de 6.600 células/μL. Por exemplo, para testar os efeitos de 100 nM fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; ver Tabela de Materiais), adicione 5 μL de 10 μM fMLP a 495 μL da suspensão de 6.667 células/μL. Para o controle negativo (não estimulado), adicionar HBSS contendo Ca2+ e Mg2+. NOTA: Para demonstrar esta metodologia, foram utilizadas as seguintes concentrações finais dos estímulos: 100 nM fMLP, 16 μM de falaxin, um peptídeo antimicrobiano de ocorrência natural14, e 100 nM PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar a 37 °C sem rotação. NOTA: Todas as alíquotas para ensaios funcionais são retiradas desta suspensão celular, doravante denominada sistema de ativação.</li>
</ol>4. Ensaio de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) para avaliação da produção de ROS
<ol><li>Preparação da solução de trabalho NBT: Para cada condição experimental, prepare uma solução de trabalho NBT (ver Tabela de Materiais) de 6 mM usando as seguintes etapas:<ol><li>Dissolver 0,0005 g de NBT em 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por pelo menos 15 min.</li>
		<li>Adicionar 90 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e vórtice até 2 min. OBS: Todas as etapas que envolvem o NBT devem ser realizadas no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar teste de lâminas NBT.<ol><li>Após 20 minutos de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira cuidadosamente 2 μL de PMN para uma lâmina de vidro limpa. Incubar durante 20 min numa câmara humidificada a 37 °C. OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação.</li>
		<li>Adicionar 1 μL da solução de trabalho NBT sobre as células e incubar durante 20 minutos protegido da luz.</li>
		<li>Seque a lâmina com ar quente e fixe-a com uma gota de metanol em cada poço por 1 min. Coloração com 0,03% de safranina (ver Tabela de Materiais) por 1 min.</li>
		<li>Lave suavemente a lâmina de vidro com água destilada.</li>
		<li>Deixe a lâmina secar ao ar e observe ao microscópio.</li>
		<li>Contar 100 células aleatórias em cada poço, diferenciando neutrófilos com e sem depósitos de formazana.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar ensaio de espectrofotometria NBT.<ol><li>Após 40 min de ativação celular, misture suavemente a suspensão celular e transfira 90 μL de PMNs do sistema de ativação para um microtubo limpo. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 μL da solução NBT 6 mM. Incubar no escuro durante 20 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS; ver Tabela de Materiais) e vórtice.</li>
		<li>Sonicate usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 60%, cinco ciclos de 15 s cada com intervalos de 15 s. Centrifugar a 12.000 x g por 5 min.</li>
		<li>Transferir 60 μL do sobrenadante para uma placa de fundo claro de 96 poços e medir a absorbância do produto formazan a 570 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ensaio de fagocitose
<ol><li>Prepare uma suspensão de 33.000 leveduras/μL para cada condição, conforme descrito abaixo:<ol><li>Adicionar aproximadamente 0,75 mg de levedura seca (Saccharomyces cerevisiae; ver Tabela de Materiais) a 200 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e incubar num termomisturador a 100 °C com 500 rpm durante, pelo menos, 15 min.</li>
		<li>Homogeneizar a mistura por vórtice e transferir 5 μL de suspensão de levedura para 45 μL de corante azul de tripano a 0,2%. Conte as leveduras usando uma câmara de Neubauer.</li>
		<li>Ajustar a concentração da suspensão inicial para 33.000 células de levedura/μL utilizando HBSS Ca2+Mg2+. Mantenha a suspensão no gelo até o uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 20 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 5 μL do sistema de ativação para 5 μL da suspensão de 33.000 leveduras/μL de Saccharomyces cerevisiae em um novo microtubo estéril. NOTA: A relação neutrófilo/levedura é de 1:5 (PMN:levedura).</li>
	<li>Transferir imediatamente 6 μL da suspensão PMN/levedura para três poços de uma lâmina de vidro limpa (2 μL cada) e incubar a lâmina em uma câmara umidificada por 40 min. OBS: Não espalhe muito a suspensão da célula sobre a lâmina; caso contrário, pode secar antes da incubação.</li>
	<li>Secar a lâmina sob ar quente e manchar com panóptica rápida, conforme descrito no passo 2.9 acima. NOTA: O terceiro passo da coloração panóptica rápida é fundamental para a análise microscópica da lâmina. A coloração da lâmina por ≥3 s nesta etapa pode torná-la imprópria para análise, uma vez que será difícil diferenciar leveduras de lobos nucleares de neutrófilos.</li>
	<li>Observar as lâminas ao microscópio, contando 100 neutrófilos aleatórios de cada poço e discriminando entre PMNs positivos e negativos para fagocitose. NOTA: Pelo menos uma partícula de levedura dentro ou em contato direto com a membrana celular PMN indica um PMN positivo para fagocitose. Se estiver interessado na relação levedura/neutrófilo, conte também o número de partículas de levedura engolfadas.</li>
</ol>6. Ensaio de quimiotaxia PMN em tempo real
OBS: O ensaio de migração é realizado de forma semelhante ao protocolo descrito anteriormente15, com as seguintes adaptações:
<ol><li>Prepare o gradiente quimiotático adicionando 160 μL de quimioatrativo (por exemplo, fMLP, IL-8, C5 ou LTB4; ver Tabela de Materiais) à câmara inferior de uma placa de análise de células em tempo real (RTCA) baseada em impedância. Para controles negativos e brancos, adicionar 160 μL de HBSS Ca2+Mg2+.</li>
	<li>Fixar a câmara superior e adicionar 25 μL de HBSS Ca2+Mg2+. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h para formar o gradiente quimiotático.</li>
	<li>Após 60 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e colocar 60 μL de suspensão celular na câmara superior. Adicionar 60 μL de HBSS Ca2+Mg2+ ao branco.</li>
	<li>Coloque a placa RTCA e programe o software RTCA para medir o índice celular (IC) a cada 60 s por 2 h. NOTA: As placas de ATR podem ser lavadas para reutilização conforme descrito anteriormente16. Em resumo, lave as câmaras e eletrodos de ATR com solução salina buferred de fosfato (PBS) três vezes, depois com água ultrapura tipo I duas vezes. Incubar a câmara inferior e superior com tripsina 0,25% 0,53 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por 40 min. Lave com água ultrapura três vezes.</li>
</ol>7. Ensaio sugestivo de NET
<ol><li>Após 10 min de ativação celular, misturar suavemente a suspensão celular e transferir 4 μL dos PMNs de cada sistema de ativação sob avaliação, divididos em dois poços de uma lâmina de vidro limpa. Incubar numa câmara humidificada a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Adicionar 1 μL de DNAse I a um dos poços e incubar durante 20 min a 37 °C (numa câmara húmida).</li>
	<li>Secar a lâmina e corar com panóptica rápida, conforme descrito anteriormente no passo 2.9 da seção "isolamento de neutrófilos".</li>
	<li>Avalie as lâminas ao microscópio. Observação : procure qualquer indicação de versão NET, caracterizada pela presença de estruturas semelhantes à Web. Uma vez identificado, confirme se o tratamento com DNAse I foi capaz de remover tais estruturas. Este ensaio é sugestivo de formação de NET, uma vez que testes adicionais são necessários para confirmar sua presença.</li>
</ol>

Ensaios funcionais de neutrófilos para triagem de diferentes vias de sinalização

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Os neutrófilos são células altamente dinâmicas e responsivas, de curta duração e ainda não podem ser criopreservados19, o que torna as investigações sobre sua biologia desafiadoras. Portanto, é essencial seguir passos cuidadosos para obter neutrófilos viáveis, enriquecidos e em repouso11,20. Este estudo empregou uma técnica de isolamento baseada em densidade que enfatiza a manipulação suave e mínima, bem como o uso de baixa...

Os neutrófilos são as células imunes inatas mais abundantes no sangue humano e são conhecidos por desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, sendo os primeiros respondedores a chegar ao local do dano tecidual1. Nos últimos anos, tem havido um crescente reconhecimento do papel crucial que os neutrófilos desempenham em uma variedade de doenças e no suporte da homeostase2. Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imune 3,4,5. Portanto, investigar os neutrófilos e suas diversas funções celulares incomuns, como quimiotaxia, migraçãoreversa6, fagocitose7, burst respiratório8 e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs)7, é imperativo em inúmeros contextos de pesquisa onde é necessário avaliar as potenciais alterações funcionais, morfológicas ou moleculares dos neutrófilos desencadeadas por condições específicas em análise.
Os neutrófilos recém-isolados são terminalmente diferenciados, de curta duração, altamente dinâmicos e facilmente ativados9. No entanto, um método de armazenamento eficiente que não afete as respostas dos neutrófilos ainda não foi alcançado, tornando desafiadora a realização de múltiplos ensaios que devem ser ininterruptos. Além disso, análises funcionais previamentedescritas10,11, baseadas em ensaios que requerem citometria e/ou coloração fluorescente, podem não ser uma escolha viável quando uma avaliação ampla e inicial dos neutrófilos é necessária.
Para resolver essas questões, este protocolo descreve um conjunto de testes que podem ser realizados após um único processo de isolamento, incluindo a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de Saccharomyces cerevisiae, cujos resultados podem ser usados para fundamentar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento, denominado NeutroFun Screen, foi projetado para abranger as principais atividades efetoras, exceto a degranulação, e pode ser concluído em um tempo médio de 4 h, incluindo 1 h de ativação. Além disso, as células remanescentes podem ser usadas para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. A vantagem desse método está no equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e precisão.
Além disso, há uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de NETs, sem marcadores específicos, mas o suficiente para indicar se mais esforços nessa direção valeriam a pena. A diversidade de funções testadas visa combinar pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo de análise e os gastos. O principal objetivo deste método é fornecer uma análise funcional equilibrada em relação à velocidade, abrangência, custo e acurácia que permita uma visão geral da resposta dos neutrófilos, tornando-se um passo inicial útil na investigação dos efeitos de novos estímulos sobre os neutrófilos de densidade normal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CIM-Plate 16</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>5665825001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLARIOstar Plate Reader&#160;</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>US Patent Number 9,733,124 
			Product details: MARS Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>DN 25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast panoptic stain</td>
			<td>Laborclin</td>
			<td>620529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Exacta</td>
			<td>7102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Blau</td>
			<td>&#160;7896014655229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>Veco</td>
			<td>VLFS-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>415501-0101-002</td>
			<td>Product details: Primostar 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixing Block</td>
			<td>BIOER</td>
			<td>MB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved bright-lined</td>
			<td>New Optik</td>
			<td>1110000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitroblue tetrazolium</td>
			<td>Neon</td>
			<td>CAS 298-83-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17089101</td>
			<td>separation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTOFIX 32 A</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td>Fleischmann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>50240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1313-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Vetec</td>
			<td>C.I. 23850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td>0K-0500-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a set of screening techniques for a quick overview of the neutrophil function

Os neutrófilos são conhecidos como uma das primeiras linhas de defesa da resposta imune inata e podem desempenhar muitas funções celulares particulares, como quimiotaxia, migração reversa, fagocitose, degranulação de enzimas e metabólitos citotóxicos e liberação de DNA como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Os neutrófilos não só têm sinalização fortemente regulada, mas também participam da regulação de outros componentes do sistema imunológico. Como os neutrófilos frescos são terminalmente diferenciados, de curta duração e altamente variáveis entre os indivíduos, é importante aproveitar ao máximo as amostras coletadas. Os pesquisadores muitas vezes precisam realizar ensaios de triagem para avaliar uma visão geral das muitas funções dos neutrófilos que podem ser afetadas por condições específicas sob avaliação. Um conjunto de testes seguindo um único processo de isolamento de neutrófilos de densidade normal foi desenvolvido para atender a essa necessidade, buscando um equilíbrio entre rapidez, abrangência, custo e acurácia. Os resultados podem ser usados para fundamentar e orientar estudos de seguimento aprofundados. Este procedimento pode ser realizado em um tempo médio de 4 h e inclui a avaliação da viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), migração em tempo real e fagocitose de leveduras em lâminas de vidro, deixando células suficientes para abordagens mais detalhadas, como estudos ômicos. Além disso, o procedimento inclui uma maneira de observar facilmente uma sugestão preliminar de TNEs após coloração panóptica rápida observada por microscopia de luz, com falta de marcadores específicos, embora suficientes para indicar se esforços adicionais nesse sentido valeriam a pena. A diversidade de funções testadas combina pontos comuns entre os testes, reduzindo o tempo e os gastos da análise. O procedimento foi denominado NeutroFun Screen e, apesar de apresentar limitações, equilibra os fatores supracitados. Além disso, o objetivo deste trabalho não é um conjunto de testes definido, mas sim uma diretriz que possa ser facilmente ajustada aos recursos e demandas de cada laboratório.

Neutrophils are the most abundant innate immune cells in human blood and are known to play a major part in infection and inflammation, being the first responders to arrive at the site of tissue damage1. In recent years, there has been a growing recognition of the crucial role that neutrophils play in a variety of diseases and in supporting homeostasis2. Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system3,4,5. Therefore, investigating neutrophils and their many unusual cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration6, phagocytosis7, respiratory burst8, and the release of neutrophil extracellular traps (NETs)7, is imperative in numerous research contexts where it is necessary to assess the potential neutrophil functional, morphological, or molecular changes triggered by specific conditions under analysis.
Freshly isolated neutrophils are terminally differentiated, short-lived, highly dynamic, and easily activated9. However, an efficient storage method that does not affect the neutrophil responses has not yet been achieved, making it challenging to perform multiple assays that must be uninterrupted. Furthermore, previously described functional analyses10,11, based on assays that require cytometry and/or fluorescent staining, may not be a viable choice when a broad and initial evaluation of the neutrophil is needed.
To address these issues, this protocol describes a set of tests that can be carried out following a single isolation process, including the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae, whose results can be used to reason in-depth follow-up studies. This procedure, named NeutroFun Screen, was designed to encompass the leading effector activities, except degranulation, and can be completed in an average time of 4 h, including 1 h of activation. Additionally, the remaining cells can be used for more detailed approaches like omics studies. The advantage of this method lies in its balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy.
Furthermore, there is a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs, without specific markers, but enough to indicate if further efforts in that direction would be worthwhile. The diversity of functions tested aims to combine common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The main goal of this method is to provide a balanced, functional analysis regarding speed, comprehensiveness, cost, and accuracy that allows for an overview of the neutrophil&#39;s response, making it a useful initial step in investigating the effects of novel stimuli on normal density neutrophils.

Autor em destaque: equilibrando velocidade, custo e precisão na avaliação da função de neutrófilos com o protocolo de tela NeutroFun 

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

The NeutroFun Screen Protocol provides a group of functional tests that use low-cost chemicals and can be performed in a single experiment from fresh neutrophils. This allows a preliminary evaluation of some major neutrophil functions to guide more laborious and expensive follow-up studies. Neutrophil research employs various modulation conditions.Such as cytokines, peptides, microbial products, and physical stimuli. Additionally, analyses flow cytometry, multiomics, microfluidic devices and immuno cytochemistry. The extensive brand of conditions and assays used in combination makes the workflow of neutrophil research long, laborious and expensive.Typically in these reduces, the number of conditions tested or the number of tests performed, the current state of the art methods require extensive configurables, many cells and lengthy preparation procedures. Our protocol NeutroFun Screen offers a quicker and more cost-effective approach to evaluate cell functionality compared to other methods. This is achieved by combining various analyses within the protocol, while maintaining accuracy and comprehensiveness in the results.Two researchers performed this workflow simultaneously for a quick overview of the neutrophil function. Researcher one isolates the PMNs, adjusts concentration and incubates the activation systems, whereas researcher two prepares materials for the subsequent cases. Then researcher one performs phagocytosis, and colorimetric NBT assays while researcher two conducts real-time migration and NBT slide tests.

O método de isolamento baseado em densidade utilizado neste estudo (Figura 1) atendeu aos critérios para os experimentos propostos. Os parâmetros neutrófilos obtidos por esse método incluíram viabilidade ≥98%, pureza ≥94% e rendimento celular ≥1,5 x 107, sem ativação detectável pelos testes de triagem. Duas etapas relevantes no isolamento dos PMNs são a anticoagulação e a remoção das hemácias. Manter o tubo de sangue anticoagulado ou a seringa em um balanço s...

Watch this Scientific Journal Video about Balancing Speed, Cost, and Accuracy in Neutrophil Function Assessment with NeutroFun Screen Protocol at JoVE.com

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

O NeutroFun Screen Protocol fornece um grupo de testes funcionais que usam produtos químicos de baixo custo e podem ser realizados em um único experimento a partir de neutrófilos frescos. Isso permite uma avaliação preliminar de algumas das principais funções dos neutrófilos para orientar estudos de seguimento mais trabalhosos e caros. A pesquisa de neutrófilos emprega várias condições de modulação.Como citocinas, peptídeos, produtos microbianos e estímulos físicos. Adicionalmente, analisa citometria de fluxo, multiômica, dispositivos microfluídicos e imunocitoquímica. A extensa marca de condições e ensaios usados em combinação torna o fluxo de trabalho da pesquisa de neutrófilos longo, trabalhoso e caro.Normalmente, nessas reduções, no número de condições testadas ou no número de testes realizados, os métodos atuais de última geração exigem extensas configuráveis, muitas células e longos procedimentos de preparação. Nosso protocolo NeutroFun Screen oferece uma abordagem mais rápida e econômica para avaliar a funcionalidade celular em comparação com outros métodos. Isso é conseguido combinando várias análises dentro do protocolo, mantendo a precisão e abrangência nos resultados.Dois pesquisadores realizaram esse fluxo de trabalho simultaneamente para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos. O pesquisador um isola os PMNs, ajusta a concentração e incuba os sistemas de ativação, enquanto o pesquisador dois prepara materiais para os casos subsequentes. Em seguida, o pesquisador um realiza fagocitose e ensaios colorimétricos de NBT, enquanto o pesquisador dois realiza testes de migração em tempo real e de lâminas de NBT.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

1.3K visualizações.  University of Brasilia. O NeutroFun Screen Protocol fornece um grupo de testes funcionais que usam produtos químicos de baixo custo e podem ser realizados em um único experimento a partir de neutrófilos frescos. Isso permite uma avaliação preliminar de algumas das principais funções dos neutrófilos para orientar estudos de seguimento mais trabalhosos e caros. A pesquisa de neutrófilos emprega várias condições de modulação.Como citocinas, peptídeos, produtos microbianos e estímulos físicos. Ad...

Vídeo: Autor em destaque: equilibrando velocidade, custo e precisão na avaliação da função de neutrófilos com o protocolo de tela NeutroFun 

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration, phagocytosis, degranulation of cytotoxic enzymes and metabolites, and release of DNA as neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system. As fresh neutrophils are terminally differentiated, short-lived, and highly variable among individuals, it is important to make the most of the collected samples. Researchers often need to perform screening assays to assess an overview of the many neutrophil functions that may be affected by specific conditions under evaluation. A set of tests following a single isolation process of normal density neutrophils was developed to address this need, seeking a balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy. The results can be used to reason and guide in-depth follow-up studies. This procedure can be carried out in an average time of 4 h and includes the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of yeast on glass slides, leaving enough cells for more detailed approaches like omics studies. Moreover, the procedure includes a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs after fast panoptic staining observed by light microscopy, with a lack of specific markers, albeit enough to indicate if further efforts in that way would be worthwhile. The diversity of functions tested combines common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The procedure was named NeutroFun Screen, and although having&#160;limitations, it balances the aforementioned factors. Furthermore, the aim of this work is not a definite test set, but rather a guideline that can easily be adjusted to each lab&#39;s resources and demands.

This protocol features a set of neutrophil functional assays to be used as a screening method to cover functions from different signaling pathways. The protocol includes an initial and simple evaluation of cell viability, purity, reactive oxygen species production, real-time migration, phagocytosis, and a preliminary suggestion of neutrophil extracellular traps.