Reconhecemos a contribuição dos profissionais de saúde voluntários. Este projeto foi apoiado pelo Departamento de Excelência 2023/2027, MUR, Itália. A AR e a DZ foram apoiadas pela PRIN2022 (fundos da UE; NextGenerationEU)

O presente protocolo foi aprovado e segue as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Verona (protocolo de aprovação número 1538). Consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos participantes do estudo. Amostras de sangue total foram coletadas de voluntários de profissionais de saúde que estavam no processo de receber vacinas anti-SARS-CoV-2. Essas amostras foram coletadas em tubos plásticos contendo anticoagulantes para posterior isolamento do soro15.
Todos os processos a seguir devem ser realizados em uma capa biológica Classe 2, trabalhando em condições estéreis. O manuseio do vírus deve ser realizado com cuidado, e todos os resíduos devem ser neutralizados em uma solução de água sanitária diluída. Uma visão geral do protocolo é exibida na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig01v2.jpg"> Figura 1: Representação gráfica de um ensaio de neutralização. (A) produção de PV, (B) titulação de PV e (C) ensaio de neutralização. Todos os procedimentos são realizados em capuz biológico classe 2 em condições estéreis. A etapa de titulação (B) precisa ser realizada para padronizar os níveis de infectividade dos PVs antes do uso no ensaio de neutralização (C). Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Produção de PVs SARS-CoV-2 e teste de infecciosidade
<ol><li>Sementes 5 x 105 células HEK293T em meio Dulbecco Modified Eagle Medium completo (DMEM, alta glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) em uma placa de 6 poços (6WP) para atingir uma densidade celular adequada compatível com o reagente de transfecção utilizado. No caso de realizar a transfecção com polietilenonimina (PEI) (preparar o reagente seguindo as instruções do fabricante), certifique-se de que as células atinjam 40-60% de densidade no dia da transfecção (passo 1.3). Manter as células em estufa umidificada a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Antes da transfecção, substitua o meio celular gasto por meio fresco sem antibióticos (DMEM, alta glicose, 10% FBS, 1% L-glutamina) para alcançar maior eficiência de transfecção. NOTA: No dia seguinte à semeadura, HEK293T células estão prontas para serem transfectadas.</li>
	<li>Transfect aderente HEK293T células com um reagente de transfecção adequado de acordo com as instruções do fabricante. Se estiver usando PEI, prepare duas misturas e siga os passos abaixo.<ol><li>Para preparar a mistura A, adicione 500 ng de pCMV-dR8.91 empacotando plasmídeo16, 750 ng de pCSFLW plasmídeorepórter 16, e 450 ng de Spike SARS-CoV-2 expressando plasmídeo em 100 μL de meio de soro reduzido.</li>
		<li>Para preparar a mistura B, adicionar 17,5 μL de PEI (concentração: 1 mg/mL) a 100 μL do meio de soro reduzido.</li>
		<li>Deixe ambas as misturas incubarem à temperatura ambiente (TR) por 5 min. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos adicionando a mistura de PEI B à mistura de DNA A.</li>
		<li>Incube o tubo por 20-30 min no RT. Agite o tubo suavemente a cada 3-4 min para melhorar a mistura. Finalmente, adicione a mistura às células HEK293T.</li>
	</ol></li>
	<li>16-20 h após a transfecção, substituir o meio de cultura por DMEM fresco e completo. Incubar a 37 °C e 5% CO2, para permitir a produção de PVs por células transfectadas.</li>
	<li>72 h após a transfecção, colher o sobrenadante contendo PVs. Em seguida, centrifugar a 1600 x g por 7 min à temperatura ambiente para remover restos celulares e células mortas e filtrá-lo através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 μm.</li>
	<li>ETAPA OPCIONAL: Para aumentar o rendimento final do título PV, realizar múltiplas transfecções, agrupar o meio celular contendo PVs e concentrá-lo usando tubos concentradores.</li>
	<li>Prosseguir directamente com os passos seguintes ("titulação PV", secção 2) ou alicitar o meio contendo PV em tubos adequados para armazenar a -80 °C até à utilização. Preparar uma alíquota adicional (400-500 μL) para ser usada para titulação. NOTA: A confecção de alíquotas múltiplas garantirá a reprodutibilidade entre os experimentos, evitando ciclos excessivos de congelamento de degelo.</li>
</ol>2. Titulação dos PVs
<ol><li>Use o meio fresco contendo PV para as próximas etapas ou descongele a alíquota de teste (etapa 1.7) para realizar a titulação do novo estoque viral. O congelamento de alíquotas do mesmo estoque fotovoltaico garantirá a reprodutibilidade.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de DMEM completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo em uso) em todos os poços de uma placa de poço de 96 (96WP) necessários para testar em duplicado o estoque fotovoltaico, deixando a linha "A" vazia. Adicione 100 μL de estoque de PVs à linha "A". Com base no número de preparações a serem testadas, deixar uma coluna sem o vírus como controle "somente célula" (Figura 2).</li>
	<li>Pipetar 50 μL da linha A para a linha B e repetir este processo até à linha G para obter diluições em série do stock inicial. Descarte o volume excedente da última linha.</li>
	<li>Destacar as células usando tripsina/ácido etilenodiaminotetracético 1x (EDTA) no tampão fosfato salino 1x (DPBS 1x) de Dulbecco, após remover o meio gasto e lavar as células com DPBS 1x duas vezes. Preparar as células para uma densidade de 4 x 105 células/mL. OBS: Neste protocolo, a infecção por PVs foi testada na linhagem celular suscetível HEK293T/ACE2; tais células foram derivadas de HEK293T, transduzidas usando um vetor lentiviral para expressar o receptor ACE2.</li>
	<li>Adicione 50 μL da suspensão celular em cada poço para garantir uma contagem de células de 2 x 104 células por poço.</li>
	<li>Incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.</li>
	<li>Após a incubação, realizar o ensaio Luciferase para obter a leitura de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 100 μL do reagente luciferase aos poços e incubar no escuro em TR por 2 min. Mova o conteúdo de cada poço para uma placa preta de 96 poços (compatível com o leitor de placas disponível) e leia as placas em um leitor de placas de 96 poços. NOTA: O luminômetro usado para a leitura da luciferase produzirá um arquivo de planilha com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (neste caso, um arquivo Excel). A infectividade do vírus será expressa em unidades de luminescência relativa (RLU) (descritas no ponto 4.1).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig02.jpg"> Figura 2: Layout representativo de uma placa de 96 poços para titulação de PVs. Um volume fixo de sobrenadante contendo PV é adicionado à linha A, colunas 1-11, e diluído em série. A última coluna é deixada como o controle "somente célula". Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Ensaio de neutralização
<ol><li>Descongelar soros dos pacientes no gelo. Inativar amostras de soro incubando-as a 56 °C por 30 min.</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços, adicionar 50 μL do DMEM fresco completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo utilizada) em cada um dos seguintes poços: da linha B (colunas 1-10) à linha H (colunas 1-10). Colocar 95 μL do DMEM fresco e completo na linha A (colunas 1-10). Adicionar 50 μL e 100 μL de DMEM completo nos poços das colunas 11 e 12, respectivamente. Estes serão os controles infectados (controle de vírus, ou CV) e não infectados (somente células ou CC), respectivamente (Figura 3).</li>
	<li>Adicionar 5 μL de amostras de soro/plasma inactivadas termicamente na linha A (colunas 1-10). Cada amostra será em duplicata. Com uma pipeta multicanal, misture as amostras na primeira fileira e mova 50 μL de meio contendo soro da linha A para a linha B. Repita esse processo até a última linha (Figura 3). Descarte os 50 μL restantes.</li>
	<li>Descongelar o número necessário de alíquotas dos PVs e diluir para ≥ 104 RLU/mL. Adicionar 50 μL do meio PV diluído a cada poço (da coluna 1 à coluna 11) utilizando uma pipeta multicanal para atingir uma diluição de 1:1 de soro/plasma inactivado pelo calor para vírus. Incubar a 37 °C e 5% CO2, por 1 h para permitir que os anticorpos nas amostras de soro se liguem à proteína spike do SARS-CoV-2 nos PVs.</li>
	<li>Preparar pelo menos 5 ml de suspensão de células suscetíveis (HEK293T/ACE2) a uma densidade celular de 4 x 105 células/ml. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.</li>
	<li>Após a incubação, realizar a leitura do ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito no passo 2.7. NOTA: O luminômetro usado para leitura de luciferase produzirá um arquivo de planilha (neste caso, .xlsx) com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (o arquivo de ensaio Luciferase).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65658/65658fig03.jpg"> Figura 3: Representação da placa com base na diluição do soro. O vermelho vivo corresponde a uma maior quantidade de soro, e a faixa azul brilhante (coluna 11) corresponde ao controle de células infectadas (CV, controle do vírus). A faixa azul clara (coluna 12) corresponde a células não infectadas (CC, controle celular). Esta figura foi criada com o BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65658/65658fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Análise de titulação
<ol><li>No arquivo de ensaio Luciferase, atribua os nomes/títulos às amostras correspondentes.</li>
	<li>Multiplique a medida de RLU pelos fatores de diluição (de cima para baixo da grade: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x) para obter RLU/mL. Se forem utilizados diferentes factores de diluição, altere os factores de multiplicação em conformidade.</li>
	<li>Calcular a RLU/mL média para cada preparação fotovoltaica.</li>
</ol>5. Análise do ensaio de neutralização de PVs
<ol><li>No arquivo de planilha do ensaio Luciferase (neste caso, .xlsx), atribua os títulos correspondentes às amostras testadas. Insira o fator de diluição da amostra (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x, 5.120x). Calcular o Log10 dos fatores de diluição.</li>
	<li>Calcular a RLU média dos controles não infectados e infectados (Figura 3, colunas 11 e 12, respectivamente). Esses valores serão úteis para a normalização na etapa 5.5.</li>
	<li>Abra um novo documento para análise de dados. Selecione Análise X/Y, insira X como Números e Y como Insira 2 valores de replicação em subcolunas lado a lado.</li>
	<li>Insira os valores Log10 (diluição) como números X. Insira a RLU duplicada das amostras.</li>
	<li>Vá para Analisar > Normalizar > Sinalizar todas as amostras na mesma folha. Insira os valores médios de VC e CC em Como é definido 0%?, e Como é definido 100%?, respectivamente. Clique em OK.</li>
	<li>Na folha de dados normalizada, vá para Analisar análises > XY > Análises não lineares (ajuste de curva). Sinalize todos os exemplos e clique em OK. Para a Dose-resposta - Inibição, selecione log(inibidor) vs resposta normalizada - inclinação variável.</li>
	<li>Em Constrain, altere HillSlope para Must menor que 0.</li>
	<li>Em Saída, sinalize Criar tabela e gráfico de resumo. Clique em OK para obter as análises finais. Uma folha de trabalho com um modelo para a análise é fornecida no Arquivo Suplementar 1.</li>
</ol>

Avaliação da neutralização sérica contra SARS-CoV-2 com vírus pseudotipados

<ol>
	<li>Ozaki, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+technology+transfer+of+a+GCLP-compliant+HIV-1+neutralizing+antibody+assay+for+human+clinical+trials.">International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials.</a> Plos One. 7 (1), e30963 (2012).</li><li>Pouget, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+liposomes+to+study+the+effect+of+Mycobacterium+tuberculosis+lipids+on+HIV-1+cis-+and+trans-infections.">Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).</li><li>McKay, L. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCV+envelope+glycoprotein+down-modulates+NF-&#954;B+signalling+and+associates+with+stimulation+of+the+host+endoplasmic+reticulum+stress+pathway.">The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-&#954;B signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).</li><li>Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+pseudovirus+system+in+the+development+of+vaccine,+antiviral-drugs,+and+neutralizing+antibodies.">Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies.</a> Microbiological Research. 258, 126993 (2022).</li><li>Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+on+the+development+of+pseudoviruses+for+enveloped+viruses.">Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses.</a> Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).</li><li>D'Apice, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+neutralizing+activity+against+SARS-CoV-2+Wuhan-Hu-1+strain+and+variants+of+concern:+Performance+evaluation+of+a+pseudovirus-based+neutralization+assay.">Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay.</a> Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).</li><li>Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+reporter-expressing+mononegaviruses:+current+challenges+and+perspectives.">Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives.</a> Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).</li><li>Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector+pseudotypes:+Precious+tools+to+improve+gene+modification+of+hematopoietic+cells+for+research+and+gene+therapy.">Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy.</a> Viruses. 12, 1016 (2020).</li><li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo.">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fourth+generation+lentiviral+Vector:+Simplifying+genomic+gymnastics.">A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).</li><li>Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+pseudovirus-luciferase+assay+for+rapid+and+quantitative+detection+of+neutralizing+antibodies+against+Enterovirus+71.">Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71.</a> Plos One. 8 (6), e64116 (2013).</li><li>Ferrara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+lentiviral+vectors+pseudotyped+with+Influenza+B+hemagglutinins:+application+in+vaccine+immunogenicity,+mAb+potency,+and+sero-surveillance+studies.">Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies.</a> Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+pseudovirus+entry+assay+to+identify+potential+viral+entry+inhibitors+and+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2.">Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.</a> Genes &amp; Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).</li><li>Dalle Carbonare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serology+study+after+BTN162b2+vaccination+in+participants+previously+infected+with+SARS-CoV-2+in+two+different+waves+versus+na&#239;ve.">Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus na&#239;ve.</a> Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).</li><li>Di Genova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+titration,+neutralisation,+storage+and+lyophilisation+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+(SARS-CoV-2)+lentiviral+pseudotypes.">Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes.</a> Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).</li><li>Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bie&#324;kowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+against+SARS-CoV-2+variants:+The+role+of+neutralization+assays.">Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+optimization+of+a+sensitive+pseudovirus-based+assay+for+HIV-1+neutralizing+antibodies+detection+using+A3R5+cells.">Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).</li><li>Gauger, P. C., Vincent, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+applications+of+SARS-CoV-2+pseudoviruses:+A+mini+review.">Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).</li><li>Zipeto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+immunodeficiency+virus+neutralizing+antibodies+using+fusion+complexes.">Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes.</a> Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).</li><li>WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: <a target="_blank" href="https://covid19.who.int">https://covid19.who.int</a> (2022)</li><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumonia+outbreak+associated+with+a+new+coronavirus+of+probable+bat+origin.">A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.</a> Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).</li><li>Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vaccination+on+the+COVID-19+pandemic+in+U.S.+states.">Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).</li><li>Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+SARS-CoV-2+Co-Infection:+From+Population+Study+Evidence+to+In+Vitro+Studies.">HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies.</a> Life. 12 (12), 2089 (2022).</li><li>Watson, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+impact+of+the+first+year+of+COVID-19+vaccination:+a+mathematical+modelling+study.">Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study.</a> The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).</li><li>Cantoni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antibody+neutralisation+activity+against+SARS-CoV-2+variants+and+seasonal+human+coronaviruses+NL63,+HKU1,+and+229E+induced+by+three+different+COVID-19+vaccine+olatforms.">Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms.</a> Vaccines. 11 (1), 58 (2023).</li><li>Siracusano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+decay+of+antibody+response+and+VOC+sensitivity+in+na&#239;ve+and+previously+infected+subjects+at+15+weeks+following+vaccination+with+BNT162b2.">Different decay of antibody response and VOC sensitivity in na&#239;ve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).</li><li>Ruggiero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+vaccination+elicits+unconventional+IgM+specific+responses+in+na&#239;ve+and+previously+COVID-19-infected+individuals.">SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in na&#239;ve and previously COVID-19-infected individuals.</a> eBioMedicine. 77, (2022).</li><li>Piubelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subjects+who+developed+SARS-CoV-2+specific+IgM+after+vaccination+show+a+longer+humoral+immunity+and+a+lower+frequency+of+infection.">Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection.</a> eBioMedicine. 89, 104471 (2023).</li><li>Zhang, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+pseudotyped+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+different+human+cell+types+and+inhibitory+effects+of+recombinant+spike+protein+and+entry-related+cellular+factors.">Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors.</a> Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).</li><li>da Costa, K. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+(N1-N9)+and+Influenza+B+(B/Victoria+and+B/Yamagata)+neuraminidase+pseudotypes+as+tools+for+pandemic+preparedness+and+improved+influenza+vaccine+design.">Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design.</a> Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).</li><li>Condor Capcha, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+SARS-CoV-2+spike+pseudotyped+virus+for+viral+entry+and+neutralization+assays:+a+1-week+protocol.">Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).</li><li>Diomede, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+a+pseudotyped+virus+transduction+does+not+translate+to+inhibition+of+SARS-CoV-2+infectivity.">Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity.</a> Viruses. 13 (9), 1745 (2021).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Embora o uso de um vírus selvagem simule a infecção real, os PVs lentivirais são uma opção mais segura para estudar os mecanismos associados à entrada e infecção viral sem os rígidos requisitos de segurança necessários para trabalhar com vírus patogênicos 4,20,21. Os PVs são compostos por um núcleo viral defeituoso de replicação circundado pela glicoproteína do envelope de superfície de um vírus patogênico,...

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares utilizadas em microbiologia para estudar interações vírus-hospedeiro e patógeno-patógeno 1,2,3,4. Os PVs consistem em uma parte interna, o núcleo viral que protege o genoma viral, e uma parte externa, as glicoproteínas do envelope na superfície do vírus que definem o tropismo5. Um pseudovírus é incompetente em replicação na célula-alvo porque não contém toda a informação genética para gerar novas partículas virais. Essa combinação de características peculiares torna os PVs uma alternativa segura a um vírus selvagem. Os vírus selvagens, por outro lado, são altamente patogênicos e não podem ser usados em laboratórios BSL 2 para análise6.
A infectividade dos PVs pode ser monitorada por um gene repórter, geralmente codificando para uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP) ou uma enzima que produz produtos quimioluminescentes (luciferase). Este está contido em um dos plasmídeos utilizados para a produção de PV e incorporado ao genoma do pseudovírus7.
Vários tipos de núcleos fotovoltaicos existem atualmente, incluindo partículas derivadas de lentivirais baseadas no genoma do HIV-1. A grande vantagem dos PVs baseados no HIV-1 sobre outras plataformas é o seu processo intrínseco de integração no genoma da célula-alvo8. Embora o HIV-1 seja um vírus altamente contagioso e seja o agente causador da AIDS, esses vetores lentivirais são seguros de usar devido às extensas etapas de otimização ao longo dos anos. Condições ótimas de segurança foram alcançadas com a introdução de vetores lentivirais de2ª geração, nos quais os genes virais foram esgotados sem influenciar a capacidade de transdução9. A3ª e4ª gerações contribuíram para o aumento da segurança do manuseio do vetor lentiviral com a divisão posterior do genoma viral em plasmídeos separados10,11. As últimas gerações de PVs são geralmente empregadas para produzir vetores lentivirais para terapia gênica.
Os PVs podem ser usados para estudar interações entre vírus e células hospedeiras, tanto durante a fase de produção quanto na de infecção. Os PVs são especialmente empregados em ensaios de neutralização de pseudovírus (PVNA). Os PVNAs são amplamente validados para avaliar o potencial de neutralização do soro ou plasma visando a glicoproteína viral no envelope do PV12,13. A atividade de neutralização, expressa como a concentração inibitória 50 (IC50), é definida como a diluição do soro/plasma que bloqueia 50% da entrada da partícula viral14. Neste protocolo, descrevemos a configuração de um PVNA para testar a atividade do anticorpo contra a Síndrome Respiratória Aguda Grave - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) em soros coletados antes e depois de receber uma dose de vacina de reforço.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83 3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10403892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>60005270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>D6546 - 500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (PBS 1x)</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-S1810-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism version 7</td>
			<td>graphpad dotmatics</td>
			<td>NA</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;data analysis program&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T/ACE2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-X0550-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Victor3</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>HH35000500</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with&#160; &#39;luminometer&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td>In the manuscript, we replace the commercial name with &#39;reduced serum medium&#39;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p8.91 packaging plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCSFLW reporter plasmid</td>
			<td>Di Genova et al., 2021</td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>145839</td>
			<td>This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>pGBW-m4137382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>steadylite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6066759</td>
			<td>In the manuscript, we replaced the commercial name with &#39;luciferase reading reagent&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1x</td>
			<td>AUROGENE</td>
			<td>AU-L0949-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pseudotyped viruses as a molecular tool to monitor humoral immune responses against sars-cov-2 via neutralization assay

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a capacidade neutralizante de amostras de soro, além de seu uso mais conhecido em terapia gênica para a entrega de um gene de interesse. Os PVs são defeituosos de replicação porque o genoma viral é dividido em diferentes plasmídeos que não são incorporados aos PVs. Este sistema seguro e versátil permite o uso de PVs em laboratórios de nível 2 de biossegurança. Aqui, apresentamos uma metodologia geral para produzir PVs lentivirais baseada em três plasmídeos como mencionado aqui: (1) o plasmídeo da espinha dorsal que carrega o gene repórter necessário para monitorar a infecção; (2) o plasmídeo de embalagem que carrega os genes de todas as proteínas estruturais necessárias para gerar os PVs; (3) plasmídeo de expressão de glicoproteínas na superfície do envelope que determina o tropismo viral e medeia a entrada viral na célula hospedeira. Neste trabalho, a Spike de SARS-CoV-2 é a glicoproteína do envelope usada para a produção de lentivírus pseudotipados SARS-CoV-2 não replicativos.
Resumidamente, as células de embalagem (HEK293T) foram co-transfectadas com os três diferentes plasmídeos usando métodos padrão. Após 48 h, o sobrenadante contendo as VVPP foi colhido, filtrado e armazenado a -80 °C. A infectividade dos PVs SARS-CoV-2 foi testada estudando a expressão do gene repórter (luciferase) em uma linhagem celular alvo 48 h após a infecção. Quanto maior o valor das unidades de luminescência relativa (RLUs), maior a taxa de infecção/transdução. Além disso, os PVs infecciosos foram adicionados às amostras de soro diluídas em série para estudar o processo de neutralização da entrada de pseudovírus nas células-alvo, medido como a redução na intensidade da RLU: valores mais baixos correspondentes à alta atividade neutralizante.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools used in microbiology to study host-virus and pathogen-pathogen interactions1,2,3,4. PVs consist of an inner part, the viral core that protects the viral genome, and an outer part, the envelope glycoproteins on the surface of the virus that defines the tropism5. A pseudovirus is replication-incompetent in the target cell because it does not contain all the genetic information to generate new viral particles. This combination of peculiar features makes PVs a safe alternative to a wildtype virus. Wildtype viruses, on the other hand, are highly pathogenic and cannot be used in BSL 2 laboratories for analysis6.
The infectivity of PVs can be monitored by a reporter gene, usually coding for a fluorescent protein (GFP, RFP, YFP) or an enzyme that produces chemiluminescent products (luciferase). This is contained in one of the plasmids used for PV production and incorporated in the genome of the pseudovirus7.
Several types of PV cores currently exist, including lentiviral-derived particles based on the HIV-1 genome. The great advantage of HIV-1-based PVs over other platforms is their intrinsic integration process in the target cell genome8. Although HIV-1 is a highly contagious virus and is the causative agent of AIDS, these lentiviral vectors are safe to use because of the extensive optimization steps over the years. Optimal safety conditions were achieved with the introduction of 2nd-generation lentiviral vectors, in which viral genes were depleted without influencing transduction capabilities9. The 3rd and 4th generations contributed to the increased safety of lentiviral vector handling with the further splitting of the viral genome into separate plasmids10, 11. The latest generations of PVs are generally employed to produce lentiviral vectors for gene therapy.
PVs can be used to study interactions between viruses and host cells, during both the production and the infection phases. PVs are especially employed in pseudovirus neutralization assays (PVNA). PVNAs are widely validated to assess the neutralization potential of serum or plasma by targeting the viral glycoprotein on the PV&#39;s envelope12,13. Neutralization activity, expressed as the inhibitory concentration 50 (IC50), is defined as the dilution of serum/plasma that blocks 50% of viral particle entry14. In this protocol, we described the set-up of a PVNA to test the antibody activity against Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sera collected before and after receiving a booster vaccine dose.

Autor em destaque: Estudando as interações hospedeiro-vírus com vírus pseudotipados 

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

Pseudotyped viruses are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test neutralizing activity of serum samples. In the work we present today, a general methodology to produce pseudotyped viruses, based on free plasmid, will be presented. For neutralization assays, Y-type viruses are generally used, but they are highly pathogenic and cannot be handled in a BSL-2 laboratories, rendering this system purely applicable on large scale.The technology of pseudo viruses can be a safer alternative compared to live virus to allow the study of pathogen to host interaction and to test neutralizing activity of antibodies. Future experiments will investigate the role of specific antibodies in the maintenance of immunity after vaccination using the technology of pseudo viruses.

Este protocolo descreve a produção de PVs SARS-CoV-2 e uma aplicação a jusante destes PVs para analisar a actividade da neutralização do soro/plasma dos indivíduos que recebem a vacinação anti-COVID-1917. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para produzir pseudotipos de cada variante de preocupação SARS-CoV-2 (VOC) para testar a evolução da resposta neutralizante. Apesar desse protocolo facilitar o estudo da resposta imune humoral após a vacinação contra a COVID-19, ele po...

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Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in ...

Vírus pseudotipados são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a atividade neutralizante de amostras de soro. No trabalho que apresentamos hoje, será apresentada uma metodologia geral para produção de vírus pseudotipados, baseada em plasmídeo livre. Para ensaios de neutralização, vírus do tipo Y são geralmente usados, mas são altamente patogênicos e não podem ser manuseados em laboratórios BSL-2, tornando este sistema puramente aplicável em larga escala.A tecnologia de pseudovírus pode ser uma alternativa mais segura em comparação com vírus vivos para permitir o estudo da interação patógeno com o hospedeiro e testar a atividade neutralizante de anticorpos. Experimentos futuros investigarão o papel de anticorpos específicos na manutenção da imunidade após a vacinação utilizando a tecnologia de pseudovírus.

pseudotyped-viruses-as-molecular-tool-to-monitor-humoral-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay

1.3K visualizações.  University of Verona. Vírus pseudotipados são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a atividade neutralizante de amostras de soro. No trabalho que apresentamos hoje, será apresentada uma metodologia geral para produção de vírus pseudotipados, baseada em plasmídeo livre. Para ensaios de neutralização, vírus do tipo Y são geralmente usados, mas são altamente patogênicos e não podem ser manuseados em laboratórios BSL-2, tornando este sistema p...

Vídeo: Autor em destaque: Estudando as interações hospedeiro-vírus com vírus pseudotipados 

Pseudotyped viruses (PVs) are molecular tools that can be used to study host-virus interactions and to test the neutralizing ability of serum samples, in addition to their better-known use in gene therapy for the delivery of a gene of interest. PVs are replication defective because the viral genome is divided into different plasmids that are not incorporated into the PVs. This safe and versatile system allows the use of PVs in biosafety level 2 laboratories. Here, we present a general methodology to produce lentiviral PVs based on three plasmids as mentioned here: (1) the backbone plasmid carrying the reporter gene needed to monitor the infection; (2) the packaging plasmid carrying the genes for all the structural proteins needed to generate the PVs; (3) the envelope surface glycoprotein expression plasmid that determines virus tropism and mediates viral entry into the host cell. In this work, SARS-CoV-2 Spike is the envelope glycoprotein used for the production of non-replicative SARS-CoV-2 pseudotyped lentiviruses.
Briefly, packaging cells (HEK293T) were co-transfected with the three different plasmids using standard methods. After 48 h, the supernatant containing the PVs was harvested, filtered, and stored at -80 &#176;C. The infectivity of SARS-CoV-2 PVs was tested by studying the expression of the reporter gene (luciferase) in a target cell line 48 h after infection. The higher the value for relative luminescence units (RLUs), the higher the infection/transduction rate. Furthermore, the infectious PVs were added to the serially diluted serum samples to study the neutralization process of pseudoviruses' entry into target cells, measured as the reduction in RLU intensity: lower values corresponding to high neutralizing activity.

Pseudotyped viruses (PVs) are replication-defective virions that are used to study host-virus interactions under safer conditions than handling authentic viruses. Presented here is a detailed protocol that shows how SARS-CoV-2 PVs can be used to test the neutralizing ability of patients' serum after COVID-19 vaccination.

Imunologia e Infecção

SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

To begin, in a six-well plate, seed one milliliter of human embryonic kidney 293T cells. Add two milliliters of complete DMEM. The next day, replace the medium with fresh antibiotic-free medium to prepare the cells for transfection.To transfect the adherent cells, first, prepare mix A by adding plasmid DNA to 100 microliters of Opti-MEM. Next, add 17.5 microliters of polyethylenimine to 100 microliters of Opti-MEM. Mix the contents of the mix A and B, then incubate.During incubation, gently flick the tube every three to four minutes to enhance mixing. Add the whole volume of the mixture to the plate with the HEK 293T cells. After 16 to 20 hours of transfection, replace the culture medium with fresh complete DMEM.Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide to produce the pseudotype viruses. After 72 hours of transfection, harvest the supernatant into a collection tube. Centrifuge the supernatant at 1, 600 G for seven minutes at room temperature.Then filter the supernatant through a 0.45 micrometer cellulose acetate filter. Distribute 50 microliters of complete DMEM in the wells of a 96-well plate. Leave row A empty.Add 100 microliters of the pseudovirus stock to the wells in row A.Next, pipette 50 microliters of the solution from row A to B.Repeat this process up to row G to obtain serial dilutions. Remove the exhausted medium from a plate with cultured susceptible HEK 293T ACE2 cells, and wash the cells with four milliliters of DPBS. Then detach the cells with one milliliter of trypsin EDTA in DPBS saline.Now add 50 microliters of the susceptible cell suspension into each well containing the pseudotype viruses. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for 48 hours. Add 100 microliters of the luciferase reagent to each well.After incubation, transfer the contents of each well into a black 96-well plate. Then read the plate in a plate reader. In a 96-well plate, add 50 microliters of fresh complete DMEM to columns one to 10 from rows B to H.Add 95 microliters of fresh complete DMEM to the corresponding wells of row A.Now add 50 microliters of complete DMEM to the wells in column 11 and 100 microliters of DMEM to column 12.Pipette five microliters of heat-inactivated serum samples to row A.With a multi-channel pipette, mix the samples in the first row and transfer 50 microliters of medium-containing serum from row A to B up to row H.Distribute 50 microliters of dilute pseudovirus containing medium to each well from columns one to 11. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide for one hour. Prepare a suspension of susceptible HEK293T ACE2 cells in five milliliters.Add 50 microliters of the cell suspension to each well, then incubate before performing the luciferase assay. Lower serum dilution resulted in decreased viral entry into the cells. This is confirmed by the increased percentage of neutralization.