Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior para pesquisa sobre SARS-CoV-2, e por bolsas do Centro Nacional de Ciência (bolsas UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).

1. Preparação do buffer
<ol><li>Para 500 mL de tampão PHEM 2x, combinar 18,14 g de piperazina-N,N′-bis(2-ácido elfônico) (PIPES), 6,5 g de 4-(2-hidroxitila)-1-piper Ácido esulfônico de eazina (HEPES), 3,8 g de ácido tetraacético etileno glicol (EGTA) e 0,99 g de sulfato de magnésio (MgSO4). Faça o volume até ~400 mL com água destilada (dH2O), mexa e ajuste o pH para 7,0 usando hidróxido de potássio de 10 M (KOH) ou hidróxido de sódio (NaOH). Faça o volume final até 500 mL e, em seguida, divida em alíquotas de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário. NOTA: O buffer não estará claro até que o pH atinja 7,0.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de 37% de paraformaldeído (PFA). Para 50 mL, misture 18,5 g de PFA e 35 mL de dH2O em uma garrafa de vidro. Coloque a garrafa em um agitador magnético com aquecimento. Adicione 900 μL de 1 M KOH ou NaOH, e mexa até que a solução fique clara. Deixe esfriar e transferir para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL; topo até 50 mL com dH2O. A solução pode ser armazenada a -20 °C até que seja necessária. NOTA: O formaldeído deve ser tratado em um capuz de fumaça enquanto usa luvas de proteção e um jaleco.</li>
	<li>Prepare o buffer de fixação (3,7% PFA tamponado com PHEM). Para 50 mL, combine 5 mL de solução PFA de 37%, 25 mL de tampão PHEM 2x e 20 mL de dH2O em um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Armazenar a -20 °C até que seja necessário. NOTA: Após o descongelamento, o buffer pode ser armazenado a 4 °C por até 3 meses.</li>
	<li>Preparar PBST (0,1% Tween-20 em 1x salina tamponada com fosfato [PBS]). Para 50 mL, adicione 50 μL de 100% Tween-20 a 50 mL de 1x PBS e misture bem. NOTA: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare buffers de reidratação combinando MeOH/PBST em proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 (volume final de 100 mL de cada; ver Tabela 1). NOTA: MeOH é muito tóxico e inflamável. Como pode danificar o nervo óptico, deve ser manuseado em um capô de fumaça evitando qualquer chama aberta. Como a mistura de MeOH e PBST gera uma reação extermática, combine as soluções no gelo.</li>
	<li>Para 1000 mL de 20x SSC, combine 175,3 g de cloreto de sódio (NaCl) e 88,2 g de citrato de sódio em um béquer, e encha com 800 mL de dH2O. Mexa até dissolver, e ajuste o pH para 7,2 usando NaOH. Adicione dH2O a um volume total de 1000 mL, e autoclave ou filtro através de um filtro de 0,22 μm em uma garrafa autoclaved.</li>
	<li>Para 50 mL de 5x SSCT, combine 12,5 mL de tampão SSC de 20x com 37,5 mL de dH2O e adicione 50 μL de 100% Tween-20. Misture bem.</li>
	<li>Para 50 mL de 50% 5x SSCT/50% PBST, combine 25 mL de 5x SSCT com 25 mL de PBST.</li>
	<li>Para 50 mL de 2x SSC, misture 5 mL de tampão SSC de 10x com 45 mL de dH2O. Misture bem. NOTA: Todos os buffers SSC devem ser armazenados em RT no escuro.</li>
</ol>2. Definição de alvo, sondas e amplificadores
<ol><li>Use as ferramentas disponíveis no site do fabricante para projetar amplificadores e sondas. Certifique-se de que as sondas são complementares à cadeia de DNA reversa do gene SARS-CoV-2 N(Figura Suplementar 1).</li>
	<li>Determine o melhor tamanho do conjunto da sonda (um conjunto de 20 sondas é suficiente para visualização).</li>
	<li>Defina os amplificadores usados para detecção de RNA de destino.<ol>
<li>Use o amplificador HCR B1 rotulado com Alexa Fluor 647. NOTA: Um amplificador HCR compreende pinos de cabelo HCR metastáveis h1 e h2. Experimentos multiplexados podem ser projetados usando este protocolo. Se isso for planejado, escolha um amplificador HCR diferente (B1, B2, ...) para que cada RNA alvo seja imagedo dentro da mesma amostra (por exemplo, amplificador B1 para o alvo 1, amplificador B2 para o alvo 2, ...).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultura celular e infecção com SARS-CoV-2
<ol><li>Cultura Vero (células epiteliais renais de macaco) no meio de Águia modificado de Dulbecco contendo 5% de soro bovino fetal.<ol>
<li>Sementes 50.000 células em tampas (nº 1, 15 × 15 mm) em uma placa de 12 poços.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare culturas HAE totalmente diferenciadas como descrito18 em suportes permeáveis de inserção transwell com uma membrana (diâmetro = 6,5 mm) e cultura em meio de crescimento epitelial brônquico até totalmente confluente.</li>
	<li>Infecção por vírus<ol>
<li>Células inoculadas com SARS-CoV-2 a 1000x dose infecciosa da cultura tecidual mediana (TCID50) por mL</li>
		<li>Incubar células por 2 h a 37 °C.</li>
		<li>Lave as células duas vezes com PBS para remover o vírus não ligado.</li>
		<li>Células de cultura por 48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SARS-CoV-2 RNA-FISH em células Vero cultivadas em deslizamentos de cobertura
DIA 1º
<ol><li>Fixação e permeabilização de células<ol>
<li>Corrija células infectadas com solução PFA de 3,7% por 1 h no RT.</li>
		<li>Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes usando 1x PBS.</li>
		<li>Permeabilize as células com solução PBST por 10 min em RT com agitação.</li>
		<li>Aspire o PBST e lave as células duas vezes com 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>detecção<ol>
<li>Aspire a solução 1x PBS e lave as células duas vezes com 2x SSC na RT.</li>
		<li>Aspire a solução 2x SSC e pré-hibridize as amostras adicionando pelo menos 300 μL de buffer de hibridização da sonda. Cubra os poços que contêm as células e incubar a 37 °C por 30 min.</li>
		<li>Prepare a solução da sonda adicionando 1,2 pmol de mistura de sonda ao buffer de hibridização da sonda.<ol>
<li>Use 1,2 μL do estoque da sonda de 1 μM para preparar 300 μL de estoque de trabalho.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova a solução de pré-lubrificação e transfira as tampas para uma câmara umidificada.<ol>
<li>Pipeta 30-50 μL de solução de sonda em parafilm para formar gotículas individuais.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) a 37 °C. DIA 2.</li>
		<li>Transfira as tampas de volta para uma placa de 12 poços e remova a solução de sonda em excesso lavando por 4 x 5 min com 400 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C. NOTA: Como alternativa para colocar alíquotas de 30-50 μl no parafilme e sob deslizamentos de cobertura para incubação, adicione 300 μL de solução de sonda diretamente para tampas em uma placa de 12 poços. Este procedimento é mais simples, mas requer quantidades substanciais de reagentes. Aqueça o tampão de lavagem da sonda a 37 °C antes de usar. Calcule a quantidade de tampão necessária e transfira-a para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL.</li>
		<li>Lave amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT na RT.</li>
		<li>Substitua a solução SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.</li>
	</ol></li>
	<li>amplificação<ol>
<li>Remova a solução 1x PBS dos poços e adicione pelo menos 300 μL de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras por 30 minutos na RT.</li>
		<li>Prepare cada grampo de cabelo HCR (h1 e h2) resfriando o volume desejado em tubos separados.<ol>
<li>Para preparar 300 μL de solução de amplificação, utilize 18 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 300 μL, use 6 μL de uma solução de grampo de estoque de 3 μM).</li>
			<li>Transfira a solução do grampo de cabelo para tubos.</li>
			<li>Incubar a 95 °C para 90 s.</li>
			<li>Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma mistura de grampos adicionando os grampos "h1" e "h2" refrigerados a snap ao tampão de amplificação.</li>
		<li>Coloque gotas de 30-50 μL de mistura de grampo de cabelo no parafilme.</li>
		<li>Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no escuro em RT. DIA 3.</li>
		<li>Transfira as tampas de volta para a placa de 12 poços e remova o excesso de grampos lavando por 5 x 5 min com 5x SSCT no RT com agitação.</li>
		<li>Aspire o buffer SSCT 5x e substitua-o por 1x PBS. NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração de núcleos (ver seção 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração nuclear e montagem de slides<ol>
<li>Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por 4′,6-diamidino-2-fenilômola (DAPI, 0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.</li>
		<li>Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.</li>
		<li>Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.</li>
		<li>Coloque duas gotas de 10 μL cada de meio de montagem; garantir que as gotas sejam separadas o suficiente para permitir que duas tampas sejam colocadas em um único slide.</li>
		<li>Remova o excesso de líquido tocando as tampas em uma toalha limpa e, em seguida, coloque-as em meio de montagem antifade com as células voltadas para baixo.</li>
		<li>Coloque as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro e deixe-as curar.</li>
		<li>Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.</li>
	</ol></li>
</ol>5. SARS-CoV-2 RNA-FISH em culturas HAE
DIA 1º
<ol start="1"><li>Fixação e permeabilização da cultura HAE<ol>
<li>Aspire o meio e corrija as células infectadas usando solução PFA de 3,7% por 1h no RT.</li>
		<li>Aspire a solução pfa de 3,7% e lave as células duas vezes com 1x PBS.<ol>
<li>Substitua a solução PFA de 3,7% por 1x PBS sob uma inserção Transwell.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Descarte o PBS e desidrate as amostras usando lavagens de 2 x 5 min com 100% de MeOH pré-100% pré-20 °C.</li>
		<li>Após a segunda lavagem, substitua o tampão por MeOH fresco e refrigerado para permeabilização sob a pastilha Transwell. Armazene durante a noite a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>DIA 2.
<ol start="2"><li>reidratação Reidratar as amostras através de uma série classificada de soluções MeOH/PBST (cada uma por 5 min) no gelo: 75% MEOH/25% PBST, 50% MEOH/50% PBST, 25% MEOH/75% PBTS e 100% PBST (duas vezes).<ol>
<li>Lave as células por 5 minutos no gelo com 50% 5x SSCT/50% PBST.</li>
		<li>Lave as células por 5 minutos no gelo com 5x SSCT.</li>
		<li>Substitua o buffer SSCT 5x por 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>detecção<ol>
<li>Incubar as células (dentro da pastilha Transwell) por 5 minutos no gelo com 100 μL de tampão de hibridização da sonda. Em seguida, transfira a placa para incubadora por 30 min a 37 °C (pré-lubrificação). NOTA: O tampão de hibridização da sonda deve ser pré-aquecido a 37 °C antes de usar. Calcule o volume necessário: 100 μL é necessário para uma única inserção Transwell.</li>
		<li>Prepare a solução da sonda. Como 1 mL de solução de sonda requer 4 pmol de sonda, adicione 4 μL de solução de estoque de sonda de 1 μM a 1 mL de tampão de hibridização da sonda e misture bem. NOTA: Para detecção de RNA, use 100 μL de solução de teste por inserção Transwell. Deixe a solução da sonda no gelo até o final da etapa de pré-lubrificação.</li>
		<li>Remova a solução de pré-lubrificação e adicione a solução da sonda.</li>
		<li>Incubar as células durante a noite (12-18 h) a 37 °C. DIA 3.</li>
		<li>Remova o excesso de sonda lavando por 4 x 15 min com 100 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.</li>
		<li>Lave as amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT no RT.</li>
		<li>Substitua o SSCT de 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>amplificação<ol>
<li>Preamplifice as amostras incubando-as com tampão de amplificação por 30 minutos no RT.</li>
		<li>Prepare cada grampo de cabelo resfriando os volumes desejados em tubos separados.<ol>
<li>Para preparar 500 μL de solução de amplificação, utilize 30 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 500 μL, use 10 μL de solução de grampo de estoque de 3 μM).</li>
			<li>Transfira a solução do grampo para os tubos.</li>
			<li>Incubar a 95 °C para 90 s.</li>
			<li>Esfrie para RT por 30 minutos no escuro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare a solução de grampo de cabelo adicionando todos os grampos refrigerados a 500 μL de tampão de amplificação no RT.</li>
		<li>Remova a solução de pré-amplificação e adicione a solução completa do grampo.</li>
		<li>Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no RT no escuro.</li>
		<li>Remova o excesso de grampos lavando com 5x SSCT no RT da seguinte forma: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.</li>
		<li>Substitua a solução SSCT 5x por 1x PBS e armazene a 4 °C por não mais de 2-3 dias ou prossiga diretamente para a coloração nuclear. NOTA: Se necessário, use as amostras de RNA-FISH em um ensaio padrão de imunofluorescência, seguido de coloração nuclear (ver seção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloração nuclear e montagem de slides<ol>
<li>Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por solução DAPI (0,2 μg/mL) em PBS 1x.</li>
		<li>Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.</li>
		<li>Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.</li>
		<li>Coloque a membrana de corte das pastilhas Transwell em 10 μL de meio de montagem antifado com as células voltadas para cima e adicione meio de montagem extra (5 μL) à membrana.</li>
		<li>Cubra as membranas com tampas.</li>
		<li>Cure as amostras montadas em uma superfície seca e plana no escuro.</li>
		<li>Após a cura, sele as bordas das tampas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análise de imunofluorescência de células Vero e culturas HAE
NOTA: Realize o ensaio de imunofluorescência no dia 3 para linhas celulares ou dia 4 para culturas HAE. Use uma abordagem diferente para cada modelo. Todas as diferenças são indicadas claramente.
<ol><li>Aspire a solução 1x PBS dos poços.</li>
	<li>Bloqueie as amostras por incubação com 1% de g/v de gânbio bovino em solução PBST por 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Prepare os anticorpos primários preparando diluições apropriadas na solução de bloqueio e incubar.<ol>
<li>Para células Vero em tampas:<ol>
<li>Coloque gotas (30-50 μL) de solução de anticorpos em parafilme em uma câmara de umidade.</li>
			<li>Coloque manchas nas gotas de anticorpos com as células viradas para baixo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para HAE, substitua o agente de bloqueio nas pastilhas por solução de anticorpos (100 μL) e incuba as amostras em uma câmara umidificada. NOTA: Ajuste a hora e a temperatura de cada incubação com anticorpo primário. Os parâmetros típicos são 2 h em RT ou durante a noite a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as amostras por 3 x 5 min com PBST.<ol>
<li>Para células em tampas, transfira para uma placa de 12 poços e adicione a solução PBST.</li>
		<li>Para culturas HAE, substitua a solução de anticorpos por solução PBST.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique as fontes de luz e filtros disponíveis para o microscópio confocal.</li>
	<li>Escolha anticorpos secundários de acordo com a espécie hospedeira. Escolha os parâmetros fluoróforos (comprimentos de onda de excitação e emissão, largura de espectro e eficiência de excitação de acordo com a fonte de luz disponível). NOTA: Os parâmetros espectrais podem ser modelados utilizando ferramentas online (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prepare soluções secundárias de anticorpos adequadas diluindo-as com a solução de bloqueio.</li>
	<li>Incubar com anticorpos secundários (como em 6,3), mas incubar por 1h a 37 °C.</li>
	<li>Lave as amostras como na etapa 6.4.</li>
	<li>Coloração nuclear e montagem de slides<ol>
<li>Para células em tampas<ol>
<li>Aspire o PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.</li>
			<li>Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.</li>
			<li>Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.</li>
			<li>Coloque as tampas em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para baixo.</li>
			<li>Sele as tampas com esmalte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para culturas HAE<ol>
<li>Aspire o 1x PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução PBS 1x.</li>
			<li>Incubar as amostras por 10 minutos no RT no escuro.</li>
			<li>Aspire a solução DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.</li>
			<li>Coloque as membranas recortados em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para cima e adicione um meio de montagem extra (5 μL) à membrana.</li>
			<li>Cubra as membranas com tampas.</li>
			<li>Sele as tampas com esmalte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Microscopia confocal
<ol><li>Defina as faixas especificando os fluoroforos utilizados.</li>
	<li>Escolha o modo de digitalização e a velocidade.</li>
	<li>Ajuste a potência do laser, ganho e valores de compensação para cada fluoróforo, comparando-os com os respectivos controles negativos: para vírus, células infectadas por simulação; para proteínas celulares, amostras manchadas com anticorpos de controle de isótipo de um hospedeiro apropriado.</li>
	<li>Para adquirir uma imagem 3D, ative o modo z-stack e defina os limites superior e inferior. Defina o tamanho/número da etapa. NOTA: Para obter mais detalhes sobre a imagem do coronavírus, consulte19.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145, (2018).</li><li>Milewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2+in+human+respiratory+epithelium.">Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium.</a> Journal of Virology. 94, (2020).</li><li>Banach, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+m(6)A+editing+of+HIV-1+mRNAs+enhances+viral+gene+expression.">Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).</li><li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures.">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li><li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+coronavirus+entry+into+cells.">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

O Imuno-RNA-FISH é um método confiável para coloração dupla de RNA e proteínas celulares. Aqui, foi descrito um protocolo modificado de imuno-RNA-FISH que permite a detecção de RNA SARS-CoV-2 e proteínas celulares em linhas celulares e culturas HAE. Este protocolo pode ser adaptado para uso em diferentes modelos celulares, incluindo monocamadas celulares ou tecidos específicos. O método se baseia no conceito de um HCR iniciado pela localização adequada da sonda. Em seguida, o uso de sondas de iniciação div...

SARS-CoV-2 é um novo betacoronavírus humano que surgiu no final de 2019, causando uma pandemia sem precedentes alguns meses depois. Como o vírus é novo na ciência, grande parte de sua biologia e seu impacto nas células hospedeiras permanecem desconhecidos. Portanto, mapear o tropismo de células vírus e tecidos durante a infecção é importante para que suas características biológicas básicas e seus efeitos sobre o hospedeiro sejam compreendidos. Várias técnicas são usadas para examinar a interação entre vírus, incluindo ensaios bioquímicos, biológicos e físicos. A hibridização in situ é um método comum que emprega dna complementar rotulado, RNA ou sondas de ácido nucleico modificado, que se localizam para sequências específicas de DNA ou RNA em uma célula ou tecido.
Foi desenvolvido um novo método de hibridização fluorescente de RNA (RNA-FISH) que incorpora modificações para aumentar a sensibilidade, amplificando a relação sinal-ruído através de um HCR1. O HCR permite o estudo da localização do RNA em um nível unicelular. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e resolução, este método é útil não apenas para estudos científicos básicos, mas também para projetos aplicativos, por exemplo, diagnósticos. Recentemente, foi demonstrada a viabilidade desse método para a detecção do RNA SARS-CoV-2 localizado em células ciliadas dentro de culturas de epitélio 3D (HAE) totalmente diferenciadas3D. As culturas hae constituem uma das ferramentas mais avançadas utilizadas para estudar a infecção viral no contexto do microambiente "infecção natural"3,4.
Vários relatórios sobre coronavírus humanos (HCoV), incluindo SARS-CoV-2, destacam a importância de modificações epigenéticas em relação à infecção por HCoV e à fisiopatologia [revisada em 5],por exemplo, o padrão de metilação do gene codificando o receptor de enzima conversor de angiotensina 2 (ACE-2)receptor 6,7. Curiosamente, a triagem em massa-espectrométrica identificou vários fatores epigenéticos que interagem com o proteome SARS-CoV-28. Mais especificamente, a proteína não estrutural 5 (NSP5) se liga ao regulador epigenético, histona deacetillase 2, e o catalítico inativo NSP5 (C145A) interage com o tRNA metiltransferase 1 (24). Além disso, a atividade de metiltransferase NSP16 é bloqueada pelo inibidor de metiltransferase, sinefungin9. No entanto, o papel exato desses fatores epigenéticos no COVID-19 ainda não está claro. A replicação do HCoV ocorre no citoplasma da célula infectada, e desencadeia respostas inflamatórias que são reguladas por modificações epigenéticas10.
Por exemplo, hCoV-229E afina a sinalização fator nuclear-kappa B e reprograma profundamente a paisagem de cromatina celular hospedeira aumentando a acetilação de H3K36 e H4K5 em certas regiões11. A infecção por coronavírus relacionada à síndrome respiratória do Oriente Médio aumenta os níveis de H3K27me3 e esgota o H3K4me3 nas regiões promotoras de subconjuntos de genes sensíveis a interferon específicos12. Além disso, o RNA viral desencadeia respostas imunes celulares, como demonstrado para os flavivírus13, retrovírus14,15e coronavírus16. Os marcadores epigenéticos no RNA viral podem desempenhar um papel no reconhecimento pelos sensores celulares, como mostrado para a metilação m7A do vírus da imunodeficiência humana-1 RNA17. No entanto, permanecem as perguntas: Qual é o impacto do RNA SARS-CoV-2 na resposta imune, e são marcas epigenéticas envolvidas?
Aqui, foi descrito um método RNA-FISH otimizado, juntamente com a análise de imunofluorescência de linhas celulares e tecidos 3D (HAE totalmente diferenciado). Embora métodos citológicos, como FISH e imunofluorescência, sejam amplamente utilizados, este método de hibridização in situ de nova geração baseado no HCR nunca foi utilizado para detecção de vírus (exceto em uma publicação recente)2. Em geral, imunostenções e PEIXEs requerem as seguintes etapas: permeabilização para permitir a penetração de sondas ou anticorpos; fixação em que o material celular é fixo e preservado; detecção em que anticorpos ou sondas de ácido nucleico são aplicadas; e, finalmente, montagem das amostras para visualização.
Embora os protocolos existentes compartilhem essas características gerais, elas variam significativamente em relação aos parâmetros envolvidos. Aqui, um protocolo otimizado, simples e imuno-RNA-FISH foi descrito para detectar RNA SARS-CoV-2 em culturas HAE e células Vero. A técnica compreende as seguintes etapas: (1) fixação de células com paraformaldeído; (2) permeabilização com detergente ou metanol (MeOH); (3) reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH (apenas culturas HAE); (4) detecção; (5) amplificação utilizando a tecnologia HCR para detectar RNA SARS-CoV-2; (6) imunostaining; e (7) imagens sob um microscópio confocal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal Microscope LSM 880</td>
			<td >ZEISS </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grant Bio, Mini Rocker- Shaker</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12965501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Incubator Galaxy170R</td>
			<td >New Brunswick</td>
			<td>CO170R-230-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermomixer Comfort</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td>5355 000 011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips</td>
			<td >LabSolute</td>
			<td >7695022</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL tubes</td>
			<td >FL-MEDICAL</td>
			<td >5.350.023.053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >12-well plate</td>
			<td >TTP</td>
			<td >92412</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical centrifuge tube</td>
			<td >Sarstedt</td>
			<td >5.332.547.254</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >serological pipets</td>
			<td >VWR Collection</td>
			<td >612-5523P, 612-5827P</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >slide glass</td>
			<td >PTH CHEMLAND</td>
			<td >04-296.202.03</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Transwell ThinCerts</td>
			<td >Grainer bio-one</td>
			<td >665641</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagents</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#946;5-tubulin </td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td > sc-134234</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >D1306</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disodium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >S51136-500G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGTA</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >EGT101.25</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Amplification Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BAM01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S013922</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >S012522</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Hybridization Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPH03821</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >PRE134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HCR Probe Wash Buffer</td>
			<td >Molecular Instruments, Inc.</td>
			<td >BPW01522</td>
			<td >Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >HEP001.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >63138-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >32213-1L-M</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Monopotassium phosphate</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5655-100G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P6148-1KG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PIPES</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >PIP666.100</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P5405-250G</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Prolong Diamond Antifade Mounting Medium</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >P36970</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >SOD001.5</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trisodium Citrate 2-hydrate</td>
			<td >POCH</td>
			<td > 6132-04-3</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >TWN580.500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence Spectraviewer</td>
			<td ></td>
			<td></td>
			<td>Modeling spectral parameters</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ Fiji</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Acquiring and processing z-stack images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of sars-cov-2 using immuno rna-fluorescence in situ hybridization

Este manuscrito fornece um protocolo para reação em cadeia de hibridização in situ (HCR) juntamente com a imunofluorescência para visualizar a síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA na linha celular e culturas tridimensionais (3D) do epitélio das vias aéreas humanas. O método permite uma visualização altamente específica e sensível do RNA viral, contando com o HCR iniciado pela localização da sonda. As sondas de iniciação dividida ajudam a amplificar o sinal por amplificadores fluorescentes rotulados, resultando em fluorescência de fundo insignificante na microscopia confocal. A rotulagem de amplificadores com diferentes corantes fluorescentes facilita o reconhecimento simultâneo de vários alvos. Isso, por sua vez, permite o mapeamento da infecção nos tecidos para entender melhor a patogênese viral e a replicação no nível unicelular. Acoplamento deste método com imunofluorescência pode facilitar uma melhor compreensão das interações hospedeiro-vírus, incluindo a alternância das vias de epigenome hospedeiro e resposta imune. Devido à tecnologia de HCR sensível e específica, este protocolo também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Também é importante lembrar que a técnica pode ser modificada facilmente para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificadas e vírus RNA que possam surgir no futuro.

O protocolo imuno-RNA-FISH descrito neste manuscrito foi realizado utilizando dois sistemas celulares: uma linha celular Vero e uma cultura 3D HAE. Os principais passos para ambos os modelos celulares são mostrados na Tabela 2. O protocolo RNA-FISH para visualização de SARS-CoV-2 nas culturas HAE inclui etapas típicas para amostras de tecido, ou seja, permeabilização com 100% meOH e reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH-PBS e 0,1% Twee...

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Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

visualization-sars-cov-2-using-immuno-rna-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.9K visualizações.  Jagiellonian University. Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.

Vídeo: Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Imunologia e Infecção

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel pathogens, such as SARS-CoV-2. Multiplex serological testing can be particularly useful because it can simultaneously analyze antibodies to multiple antigens that optimizes pathogen coverage, and controls for variability in the organism and the individual host response. Here we describe a SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescent microsphere-based assay that can detect both IgM and IgG antibodies to three major SARS-CoV-2 antigens-the spike (S) protein, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptor-binding domain (RBD), and nucleocapsid (Nc). The assay was shown to have comparable performance to a SARS-CoV-2 reference assay for IgG in serum obtained at &#8805;21 days from symptom onset but had higher sensitivity with samples collected at &#8804;5 days from symptom onset. Further, using soluble ACE2 in a neutralization assay format, inhibition of antibody binding was demonstrated for S and RBD.

A flow analysis system for bead-based multiplexed assays which provides a two-reporter readout was used for the development of multiplex serological and antibody neutralization assays that can simultaneously measure neutralizing IgG and IgM antibodies for SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The increasing number of SARS-CoV-2 infections raises the need for better antibody detection assays. Current antibody detection methods compromise sensitivity for speed or are sensitive but time-consuming. A large proportion of SARS-CoV-2-neutralizing antibodies target the receptor-binding domain (RBD), one of the primary immunogenic compartments of SARS-CoV-2. We have recently designed and developed a highly sensitive, bioluminescent-tagged RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) to detect SARS-CoV-2 antibodies. The following text describes the procedure to produce the HiBiT-RBD complex and a fast assay to evaluate the presence of RBD-targeting antibodies using this tool. Due to the durability of the HiBiT-RBD protein product over a wide range of temperatures and the shorter experimental procedure that can be completed within 1 h, the protocol can be considered as a more efficient alternative to detect SARS-CoV-2 antibodies in patient serum samples.

The outlined protocol describes the procedure for producing the HiBiT-receptor-binding domain protein complex and its application for fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibodies.

Detecção de anticorpo de domínio de ligação receptor sars-cov-2 usando um biorelato de domínio baseado em HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has been responsible for over 242 million infections and more than 4.9 million deaths worldwide. Similar to other viruses, studying SARS-CoV-2 requires the use of experimental methods to detect the presence of virus in infected cells and/or in animal models. To overcome this limitation, we generated replication-competent recombinant (r)SARS-CoV-2 that expresses bioluminescent (nanoluciferase, Nluc) or fluorescent (Venus) proteins. These reporter-expressing rSARS-CoV-2 allow tracking viral infections in vitro and in vivo based on the expression of Nluc and Venus reporter genes. Here the study describes the use of rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus to detect and track SARS-CoV-2 infection in the previously described K18 human angiotensin-converting enzyme 2 (hACE2) transgenic mouse model of infection using in vivo imaging systems (IVIS). This rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus show rSARS-CoV-2/WT-like pathogenicity and viral replication in vivo. Importantly, Nluc and Venus expression allow us to directly track viral infections in vivo and ex vivo, in infected mice. These rSARS-CoV-2/Nluc and rSARS-CoV-2/Venus represent an excellent option to study the biology of SARS-CoV-2 in vivo, to understand viral infection and associated COVID-19 disease, and to identify effective prophylactic and/or therapeutic treatments to combat SARS-CoV-2 infection.

This protocol describes the dynamics of viral infections using luciferase- and fluorescence-expressing recombinant (r)SARS-CoV-2 and an in vivo imaging systems (IVIS) in K18 hACE2 transgenic mice to overcome the need of secondary approaches required to study SARS-CoV-2 infections in vivo.

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

Eficiente SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizando robôs de pipetação de código aberto

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Quantificando anticorpos neutralizantes induzidos por vacina em variantes do SARS-CoV-2

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 variants and the effectiveness of vaccine-induced neutralizing antibodies against viral variants. These assays are essential for pandemic surveillance and validating vaccines and variant-specific boosters. This manuscript demonstrates the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) for quick quantification of SARS-CoV-2 variant infectivity and vaccine-induced neutralizing antibodies to viral variants. Ha-CoV-2 is a SARS-CoV-2 virus-like particle consisting of viral structural proteins (S, M, N, and E) and a fast-expressing RNA genome derived from an alphavirus, Semliki Forest Virus (SFV). Ha-CoV-2 also contains both green fluorescent protein (GFP) and luciferase reporter genes that allow for quick quantification of viral infectivity. As an example, the infectivity of the SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) and the Omicron (B.1.1.529) variants are quantified, and their sensitivities to a neutralizing antibody (27VB) are also measured. These examples demonstrate the great potential of Ha-CoV-2 as a robust platform for rapid quantification of SARS-CoV-2 variants and their susceptibility to neutralizing antibodies.

Autor em destaque: Um sistema de vírus de pseudotipo para avaliar subvariantes Omicron e anticorpos neutralizantes na pesquisa de SARS-CoV-2

This protocol describes the application of a novel hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirus (Ha-CoV-2) as a platform for rapid quantification of infectivity of SARS-CoV-2 variants and their sensitivity to neutralizing antibodies.

Aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2 para quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...

Methods Article

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização