Para nosso conhecimento, este é o primeiro exemplo de um protocolo multiplexador baseado em contas que usa dois sinais de repórter para medir simultaneamente dois resultados por analito. Esta técnica permite ao usuário medir IgM e IgG específicos de antígeno ao mesmo tempo, com menos amostra e um tempo menor para resultados. Embora este método de repórter duplo seja específico para isotipagem de anticorpos, ele poderia ser adaptado para medir outros pares de analitos, como modificações pós-translacionais ou formas de drogas livres versus ligadas.
Demonstrando nosso procedimento hoje, temos o Dr. Steve Angeloni, um cientista sênior de aplicativos de campo da Luminex Corporation. Para iniciar o ensaio sorológico IgG e IgM do repórter duplo, prepare as misturas de contas multiplex necessárias do casal individual e controle as ações de contas em uma concentração de uma vez 10 para as seis contas por mililitro. Em seguida, diluir as amostras de soro 100 vezes adicionando 10 microliters de soro a 990 microliters de tampão PBS-TBN, em seguida, diluir as amostras mais dez vezes adicionando 20 microliters da diluição de 1:100 a 180 microliters de PBS-TBN.
Quando as misturas de contas e amostras de soro estiverem prontas, adicione 50 microliters das misturas de contas multiplex aos poços atribuídos de uma placa de microtiter não vinculante de 96 poços, em seguida, adicione 50 microliters das amostras de soro diluído aos poços apropriados. Uma vez adicionadas todas as amostras, cubra a placa com uma vedação de papel alumínio microplacar e incubar em um agitador de placa aquecido a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, separe as contas da mistura de reação colocando a placa em um separador de placa magnética por dois minutos.
Mantendo a placa no ímã, remova o selo de papel alumínio. Em seguida, inverta cuidadosamente a placa sobre um recipiente de lixo e gentilmente tire o supernatante dos poços. Enquanto ainda segura a placa no ímã, borre a placa em papel absorvente.
Para lavar os poços de reação, remova a placa do ímã da placa e adicione 150 microliters de PBS-TBN a cada poço. Cubra a placa com uma vedação de papel alumínio fresco e incubar no shaker aquecido por dois minutos antes de colocá-la de volta no ímã da placa por mais dois minutos. Enquanto mantém a placa no ímã, inverta a placa para descartar o supernatante, e borre a placa em papel absorvente.
Após a segunda lavagem PBS-TBN, remova a placa do ímã e adicione 100 microliters de mistura de reagente de detecção fresca a cada poço. Depois de cobrir a placa com uma vedação de papel alumínio microplaca, coloque-a em um agitador de placa aquecida por 15 minutos e, em seguida, em um separador de placa magnética por dois minutos. Enquanto a placa estiver no ímã, descarte a mistura de reagente de detecção invertendo a placa sobre um recipiente de resíduos e manchando-a em papel absorvente.
Lave os poços de reação com PBS-TBN duas vezes mais do que demonstrado anteriormente e, em seguida, remova a placa do ímã. Adicione 100 microliters de PBS-TBN a cada poço, depois cubra a placa com selo de papel alumínio e agite por dois minutos a 37 graus Celsius. Remova o selo de folha e continue a ler 50 microliters da amostra de cada poço no analisador de fluxo.
Para ler a placa, selecione o menu suspenso no canto superior esquerdo, navegue até a configuração da placa, carregue a placa configurada anteriormente e selecione Placa de execução. Ejete o porta-placas selecionando o ícone Ejetar, em seguida, carregue a placa no porta-placas e selecione o ícone Retrair para retrair o porta-placas. Uma vez que o portador da placa tenha prolongado o analisador, selecione o ícone Executar para começar a ler a placa.
Para o ensaio de neutralização de repórter duplo, adicione 50 microliters das misturas de contas multiplex aos poços atribuídos de uma placa de microtiter não vinculante de 96 poços, em seguida, adicione 25 microliters de dois microgramas por mililitro ACE2 para cada poço, e cobriu a placa com uma vedação de papel alumínio. Após uma incubação de dois minutos em um agitador de placas aquecidas, adicione 25 microliters de diluições de soro de 1:500 aos poços atribuídos. Uma vez adicionadas todas as amostras, realize as etapas de incubação, lavagem, detecção e análise, como demonstrado anteriormente para o ensaio sorológico.
Um teste de anti-IgM conjugado ao dylight 405 repórter tingimento usando amostras de soro dentro de cinco a 60 dias do início do sintoma e uma amostra de soro de tira IgG não produziu um alto sinal para o antígeno de espeto. Para amostras com alta intensidade de fluorescência média IgM, os sinais mais altos foram vistos para o domínio de ligação receptora e antígenos nucleocapsídeos. Embora o título de IgM deva ter sido elevado em algumas amostras, os níveis de intensidade de fluorescência média observados não excederam 140 unidades de IFI.
Além disso, a conta de controle para IgM não tinha um alcance dinâmico significativo para intensidade de fluorescência mediana ao usar DyLight 405 conjugado a anti-IgM em comparação com uma ficoerthrin rotulada anti-IgM na mesma concentração. Para detecção de IgG, o conjugado violeta brilhante tinha sinais de intensidade de fluorescência mediana mais altos do que o conjugado streptavidin do fluorphore Super Bright 436. No entanto, a intensidade do sinal para o conjugado violeta brilhante variou entre as titulações ACE2.
Esta flutuação de sinal pelo conjugado violeta brilhante através das concentrações ACE2 também interferiu na determinação da inibição percentual por ACE2 através da gama de títulos IgG. Para detecção de IgM, a ficoerythrina anti-IgM exibiu sinais mais altos do que os gerados pelo IgM anti-humano DyLight 549. Ao determinar a inibição de ACE2 por cento da ligação IgM, houve uma pequena, mas insignificante diferença entre os dois reagentes de detecção de IgM.
Então, um dos passos mais importantes no procedimento é preparar seu mix de contas multiplex a partir de seus estoques individuais de contas e certifique-se de fazer isso corretamente. Assim, este procedimento também pode ser usado para medir a eficácia das vacinas e monitorar as respostas imunes a outros patógenos também.
