Apoiado em parte pela Vanderbilt CTSA conceder um UL1 RR024975 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, National Institutes of Health. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

Para o protocolo a seguir, usamos células mononucleares do sangue periférico (PBMC) como as células de interesse. No entanto, este protocolo pode ser usado com outros tipos celulares. Realizar o ensaio em uma capa de cultura de tecido usando a técnica estéril. Dia 1: Elaboração de Placa e Células <ol><li> Tirar uma placa de ELISPOT e abri-lo no bairro. </li><li> Lavar a placa 3 vezes com 150 mL de PBS 1X usando um pipetador multicanal, se disponível, caso contrário, pipetagem único bem é aceitável. </li><li> Retire um pacote de reservatórios e abri-lo no capô. </li><li> Adicione 2 mg / mL do anticorpo de captura, anti-humana Interferon-γ, a 11 mL de PBS 1X. Vortex bem. Transferência mix de anticorpos para um reservatório. </li><li> Lugar de 100 L da solução de revestimento em cada poço usando o multicanal. </li><li> Embrulhe a placa em parafilme. </li><li> Coloque o prato na geladeira durante a noite. As placas são boas para a semana. A regra de ouro é que se houver ainda resta de líquido nos poços, a placa pode ser utilizada. </li></ol> Preparação de células Se o PBMCs são frescos, em seguida, contar as células e incubar durante a 37 ° C com 5% de CO 2. Para PBMC armazenados em nitrogênio líquido, o descongelamento de células é necessário. O protocolo é o seguinte: <ol><li> Descongele a cryovial de células em 37 ° C banho-maria até quase completamente descongelado. </li><li> Imediatamente ressuspender em 5 mL de R10 mídia. </li><li> Rodada por 5 minutos a 225 x g. </li><li> Ressuspender novamente em 5 mL de R10 media e contagem de células viáveis ​​com azul de tripano. </li><li> Traga concentração para 2 x 10 6 células / mL em R10 mídia. </li><li> Descansar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> Dia 2: Configurar a placa de <ol><li> Tampa etiqueta da placa com o número de amostras de identificação, condições de bem, e data. </li><li> Lave a placa 6 vezes com 150 mL de PBS estéril 1x usando o dump e método blot. Tenha cuidado para não espirrar a placa enquanto dumping. Isso pode causar as cavidades da placa para girar o roxo. </li><li> Adicionar 100 mL de R20 a cada poço. </li><li> Incubar a placa a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Enquanto a placa é a incubação, contar as células que foram descansou durante a noite. </li><li> Gire a suspensão celular a 1500 rpm por 5 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento para que você tenha uma concentração final de 1x10 6 células por 1mL em R10 mídia. </li><li> Após a incubação de 1 hora, retire o R20 com o despejo e método blot. Tenha cuidado para não espirrar a placa enquanto dumping. </li><li> Adicionar 100 mL de solução de célula (10 5 células) em cada poço. Adicionar peptídeos apropriados e / ou antígenos para os poços correspondentes em duplicata. Use uma ponteira de pipeta nova cada vez que você entrar na solução de peptídeo de trabalho. Concentração de peptídeo normal é 10-40 mcg / mL. Desde peptídeos variam, cada investigador deverá titular peptídeos para obter os melhores resultados. </li><li> Nos poços de controlo negativo, apenas adicionar células (sem peptídeos) </li><li> Nos poços de controlo positivo, adicione fitohemaglutinina (PHA, 10 mcg / mL; Sigma). </li><li> Incubar durante a 37 ° C com 5% de CO 2 (~ 18 horas). </li></ol> Dia 3: Desenvolvimento da Prata <ol><li> Lave a placa 6 vezes com 150 mL 1xPBS usando o dump e método blot. </li><li> Adicionar 100 mL PBS a cada poço da placa usando o pipetador multicanal. </li><li> Coloque o prato na geladeira por 15 minutos. </li><li> Pegue a placa fora da geladeira e colocá-lo na capa de cultura de tecidos. </li><li> Prepare a solução de anticorpos biotina <ul><li> Adicionar 0,5 mg / mL de anticorpos biotina (MAB 7-B6-1) para 11mL PBS. </li><li> Vortex da solução para misturar bem. </li><li> Se o planejamento para adicionar a solução com um multicanal, derramá-la em um reservatório. </li></ul></li><li> Descartar a PBS sacudindo-a na lixeira. Tenha cuidado para não espirrar a placa enquanto dumping. </li><li> Lugar de 100 L da solução em cada poço. </li><li> Incubar a placa na capa de cultura de tecido em temperatura ambiente por uma hora. </li><li> Lavar placa 6 vezes com 150μL 1xPBS usando o dump e método blot. Sobre a lavagem 6 º, deixe o PBS sobre a placa até que você tenha preparado o anticorpo Estreptavidina. </li><li> Prepare o anticorpo Estreptavidina. <ul><li> Adicionar 5,5 μ l Estreptavidina anticorpos (estreptavidina-ALP) para 11mL de PBS (diluição 1:2000). </li><li> Vortex da solução para misturar bem. </li><li> Se o planejamento para adicionar a solução com um multicanal, derramá-la em um reservatório. </li></ul></li><li> Descartar as restantes PBS nos poços e inverter a placa. </li><li> Adicionar 100 mL de solução de estreptavidina a cada poço. </li><li> Incubar a placa na capa de cultura de tecido em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Lavar as placas 6 vezes com PBS usando o dump e método blot. Sobre a lavagem 6 º, deixe o PBS sobre a placa até que você tenha feito a solução de cor. </li><li> Trabalhar no escuro. Preparar a solução de substrato de fosfatase alcalina (Alcalina Fosfatase Substrato Kit IV BCIP / NBT): <ul><li> Adicione 4 gotas de reagente substrato 1-11 mL Tris buffer, vortex bem. Adicione 4 gotas do reagente substrato 2 a Tris buffer, vortex bem. Adicione 4 gotas do reagente substrato 3 a Tris buffer, vortex bem. </li></ul></li><li> Descartar as restantes PBS e inverter a placa. </li><li> Adicionar 100 mL da solução de cor a cada poço da placa usando o multicanal. </li><li> Acender a luz depois de 5 a 10 minutos de cor em desenvolvimento. </li><li> Permitir que os reagentes de cor para permanecer na placa até que as manchas começam a ficar roxo e são bastante escuro. Isso deve levar de 5 a 20 minutos. Tenha cuidado para não deixar a solução de substrato por muito tempo, pois isso poderia causar alto background. </li><li> Lave a placa ELISPOT 3 vezes com água da torneira. </li><li> Deixar secar durante cerca de uma hora ou durante a noite. </li><li> Leia placa manualmente ou com ELISPOT leitor de placas. </li><li> Armazenar a placa em uma caixa longe da exposição de luz. </li></ol> Resultados representativos: ELISPOT foi projetado para quantificar as respostas imunológicas contra antígenos microbianos. Cada ponto indica uma única célula sensível, expressando a citocina de interesse. As manchas podem ser contados manualmente ou utilizando um leitor de placas ELISPOT. Avaliação de que o ELISPOT tem sido realizada corretamente deve começar com a investigação do controle negativo para a produção de fundo da citocina de interesse. Nos poços de controlo negativo seria de esperar para ver nenhum ponto, apesar de um pouco de fundo (cor púrpura) podem estar presentes. Normalmente, não deve ser inferior a uma média de cinco pontos por poço. Os poços de controlo positivo confirmar que a reação tenha sido realizada corretamente, e que as células respondem ao estímulo antigênico. Nos poços de controlo positivo que você esperaria ver um fundo roxo profundo devido a uma confluência de pontos (fig. 1). Deve haver pouca ou nenhuma fundo branco. Se o controle positivo e amostras de controlo negativo são apropriados, pode-se contar os poços contendo o antígeno de interesse. Um resultado &quot;subótima&quot; seria refletida pela alta de fundo (os poços são roxo), sem manchas ou pontos muito poucos, o centro em branco, manchas mal definida ou pontos confluentes. Uma lista de dicas de solução é fornecida (Tabela 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Figura 1. Um representante da chapa de ELISPOT. Cada chapa deve conter um controle positivo, controle negativo e peptídeos de interesse realizados no mínimo em dois poços. C9, C10, D9 e D10 são os poços de controlo positivo, como você pode ver, há uma cor arroxeada, as células confluentes e dificilmente qualquer fundo branco. Os poços de controlo negativo são G11, G12, H11 e H12. Estes poços não tem fundo roxo e sem manchas como esperado. As manchas G7, G8, H7 e H8, ilustrar respostas celulares a peptídeos microbianos; os pontos roxos representam uma única célula sensível expressando a citocina de interesse. Tabela 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Observação </td><td> Problema Possível </td><td> Solução possível </td></tr><tr><td> Elevado ruído de fundo </td><td> 1. Ambos os lados da membrana não lavadas adequadamente 2. Citocina muitas células secretoras 3. Placa não secas adequadamente 4. Sobre a placa desenvolvida </td><td> 1. Lavar ambos os lados da membrana com água destilada antes e após o desenvolvimento da cor. Reagentes podem vazar através da membrana na base da placa, e estes podem causar alto background, se não lavados. 2. Reduzir o número de células por poço, isto exigirá otimização 3. Secar a placa mais antes de ler 4. Reduzir o tempo de desenvolvimento </td></tr><tr><td> Sem manchas / Spots Muito poucos </td><td> 1. Não o suficiente células secretoras de citocinas / proteína de interesse 2. Assegurar que as células são estimuladas corretamente 3. Células não incubadas por long suficiente ou pode levar algum tempo para responder a estimulante 4. Desenvolvimento de cor inadequada 5. Anticorpos não é suficiente primária ou secundária </td><td> 1. Aumentar o número de células. Isso exigirá a otimização 2. Também usar um controle de estimulação positiva - um estimulante que você sabe que vai induzir a expressão do seu citocina / proteína de interesse 3. Aumentar o tempo de incubação da célula ou utilizar o método indirecto (pré-tratamento de células com estimulante) 4. Monitorar o desenvolvimento de cor com um microscópio de sobrecarga e assegurar que os reagentes em desenvolvimento têm sido armazenados corretamente e não perdeu a atividade da 5. Concentração do anticorpo primário e / ou secundário terá de ser aumentado. Isso vai exigir de otimização. </td></tr><tr><td> Áreas em branco </td><td> 1. Membrana não pré-tratados 2. Membrana secou em algum estágio 3. Células distribuídas de forma desigual </td><td> 1. Garantir a membrana é adequadamente pré-tratados com etanol 70% (todas as membranas não precisa deste modo a verificar com o seu fornecedor). Lave bem com PBS 3X depois 2. Garantir a membrana não seca 3. Certifique-se de misturar as células com cuidado para ter uma boa suspensão de células homólogas antes de pipetar para fora dos poços </td></tr><tr><td> Centro em branco </td><td> 1. Danos da lavagem </td><td> 1. Taxa de fluxo na máquina de lavar automática (ou pipetagem) pode ser muito alto. Precisa de um procedimento de lavagem mais suave </td></tr><tr><td> Falsos positivos </td><td> 1. Secundário de agregados de anticorpos 2. Células ainda na membrana 3. Contaminação de cultura de células </td><td> 1. Filtrar o anticorpo secundário 2. Garantir que todas as células são lavadas da membrana com PBS Tween 20 antes da incubação do anticorpo secundário. Células à esquerda na membrana dará irregular manchas em forma 3. Manter reagentes como estéril e limpo possível. Garantir a sua técnica de cultura de células é asséptica. Verifique se há falsos positivos, executando um controle de mídia negativa. Para o movimento das placas, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">ver os pontos mal definidos</a> </td></tr><tr><td> Spots confluentes </td><td> 1. Pobres revestimento, anticorpos muito 2. Cultura de células prolongada 3. Células sobre-estimulados </td><td> 1. Reduzir a concentração de anticorpo primário 2. Quanto mais tempo as células são incubadas, mais de citocinas / proteína eles secretam. Isto irá resultar em manchas maiores, que vai começar a se fundir e tornar-se indistinguíveis. 3. Reduzir o tempo de incubação de cultura de células passo. Sobre-estimulação resultará em uma grande quantidade de citocina / proteína que está sendo secretada pela célula. Isto irá produzir spots que vão começar a se fundem e tornam-se indistinguíveis. Reduzir a quantidade de estimulantes nos meios de cultura ou cultura para um curto período de tempo </td></tr><tr><td> Spots mal definidas </td><td> 1. Membrana não pré-tratados (se sua membrana exige isso, verifique com o fornecedor) 2. Movimento da placa durante a incubação de células </td><td> 1. A membrana deve ser pré-tratados com etanol ou isso pode resultar em fuzzy, spots mal definidos. Vai ser difícil para o leitor a distinguir estes 2. Não permita que a placa se mover durante a incubação de células como as células que se mudaram irá criar mais de um ponto. Se possível, use uma incubadora dedicada que não será aberto durante a incubação. Não toque na placa após a adição de células </td></tr><tr><td> Controle positivo poços é baixa </td><td> 1. Subdesenvolvimento - pode ser resultado do uso de streptavidina-ALP e / ou BCIP / NBT soluções que não foram trazidas à temperatura ambiente </td><td> 1. Trazer os reagentes à temperatura ambiente antes de adicionar aos poços </td></tr><tr><td> Densidade dos pontos faz com que seja difícil quantificá-los </td><td> 1. Células demais foram adicionados aos poços </td><td> 1. Fazer diluições de células (ou seja, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 células por poço) para determinar o número ideal de células que irá resultar na formação de pontos distintos </td></tr></tbody></table>

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	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio de ELISPOT tem emergido como um dos ensaios mais importantes e amplamente utilizados para monitorar as respostas imunes em humanos e uma variedade de outras espécies. Com o ensaio ELISPOT, as freqüências de células imunes podem ser medidos no nível da célula única, sem expansão ou a manipulação de populações de células. ELISPOT tem sido amplamente aplicado para investigar antígeno específico respostas imunes em várias doenças, incluindo infecções, câncer, alergias e doenças auto-imunes. A a...

A. Preparação de Mídia <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Materiais A" /> B. Elaboração de Tris tampão <ol><li> Adicione 800 ml de DDH 2 O a 1 copo L. </li><li> Medida 12 gramas de Tris e adicione ao copo. </li><li> Adicionar 0,12 gramas de cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl 2: 6H 2 O) no copo. </li><li> Mexa com vara de agitação magnética na placa de agitação automática. </li><li> Uma vez dissolvido, pH da solução para 9,5. </li><li> Adicionar 200 mL de DDH 2 O para o copo, levando-o até 1000ml. </li><li> Filtrar a solução com um filtro de 0,22 mM. </li></ol> C. Materiais necessários para as análises ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Materiais B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

Imunidade adaptativa é um componente importante para eliminação de patógenos intracelulares. A capacidade de detectar e quantificar essas respostas em seres humanos é uma importante ferramenta de diagnóstico. O ensaio de enzyme-linked immunospot (ELISPOT) está ganhando popularidade por sua capacidade de identificar respostas imunes celulares contra antígenos microbianos, incluindo populações imunossuprimidos, como aqueles com infecção pelo HIV, transplante e uso de esteróides. Este ensaio tem a capacidade de quantificar as respostas imunes contra antígenos microbianos específicos, bem como distinguir se estas respostas são Th1 ou Th2 em caráter. ELISPOT não se limita ao local da inflamação. É versátil na sua capacidade para avaliar a resposta imune no sangue periférico, bem como sites de envolvimento ativo, como lavado broncoalveolar, líquor cerebral, e ascite. Detecção de resposta imunológica contra um antígeno único ou múltiplo é possível, bem como epitopos específicos dentro de proteínas microbianas. Este ensaio facilita a detecção das respostas imunes ao longo do tempo, assim como distinções na antígenos reconhecidos pelas células T host. Ensaios de ELISPOT dupla de cores estão disponíveis para a detecção de expressão simultânea de duas citocinas. Aplicações recentes para esta técnica incluem o diagnóstico de tuberculose extrapulmonar, bem como a investigação da contribuição de antígenos infecciosos de doenças auto-imunes.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K visualizações.  Vanderbilt University School of Medicine. Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Imunologia e Infecção

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

Avaliando as respostas imunes respiratórias ao Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...