Diese Arbeit wurde durch das National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (Nr. 82027803) finanziert.

1. Auftauen von kryokonservierten RSC96-Zellen
<ol><li>Tauen Sie das Kryofläschchen mit 1 ml Zellsuspension auf, indem Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell schütteln, und geben Sie es dann in ein Zentrifugenröhrchen mit 4-6 ml vollständigem Kulturmedium und mischen Sie es gut.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 3-5 Minuten lang bei 1000 x g , verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 mL vollständigem Kulturmedium.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in einen Kulturkolben (oder eine Schale) gegeben, der 6-8 ml vollständiges Kulturmedium enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubiert.</li>
	<li>Beobachten Sie am nächsten Tag das Zellwachstum und die Zelldichte unter dem Mikroskop.</li>
</ol>2. Zellpassage:
HINWEIS: Wenn die Zellendichte 80%-90% erreicht, ist es bereit für den Durchgang.
<ol><li>Entsorgen Sie das Nährmedium und spülen Sie die Zellen 1-2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium- und Magnesiumionen.</li>
	<li>0,25 % (w/v) Trypsin-0,53 mM EDTA in den Kulturkolben geben (1-2 mL für einen T25-Kolben, 2-3 mL für einen T75-Kolben) und 1-2 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Wenn die meisten Zellen rund werden und sich ablösen, stellen Sie den Kolben schnell wieder in den Arbeitsbereich, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben und fügen Sie 3-4 ml Kulturmedium mit 10 % FBS hinzu, um den Verdau zu stoppen.</li>
	<li>Mischen Sie den Inhalt, aspirieren Sie die Lösung und zentrifugieren Sie sie bei 1000 x g für 5 min. Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 1-2 ml frisches Kulturmedium hinzufügen und vorsichtig pipettieren.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird im Verhältnis 1:2 in einen neuen T25-Kolben überführt und 7 ml Kulturmedium hinzugefügt.</li>
</ol>3. Betrieb des nsPEF-Geräts
<ol><li>Resuspendieren Sie die RSC96-Zellen in 1 mL DMEM-Kulturmedium und überführen Sie sie in kolorimetrische Schalen mit Elektroden auf beiden Seiten.</li>
	<li>Schalten Sie den Netzschalter ein.</li>
	<li>Passen Sie die Parameter an, indem Sie den Knopf am Instrument drehen, um die Intensität des elektrischen Feldes zu ändern. Die in dieser Studie festgelegten Intensitäten betragen 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm und 40 kV/cm.</li>
	<li>Drehen Sie die Elektroden vorsichtig, bis Funken entstehen, so dass die Zellen 5 Impulse von nsPEF entsprechend den voreingestellten Feldstärkeintensitäten empfangen können, bevor Sie die beiden Elektroden sofort trennen. Nach dieser Behandlung werden die mit nsPEF behandelten Zellen der Versuchsgruppe und die unbehandelten Zellen der Kontrollgruppe nach einer bestimmten Zeit der Zellkultur (1 Tag in diesem Experiment) die Abschnitte 4 bis 6 durchgeführt.</li>
</ol>4. Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay
<ol><li>Bereiten Sie eine Zellsuspension einer bestimmten Konzentration aus RSC96-Zellen vor, die durch elektrische Stimulation stimuliert wurden. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte. Unter Berücksichtigung der Anforderungen des CCK-8-Assays ist die Gesamtzahl der Zellen im Reagenzkit zwischen 1 x 103 und 1 x 106 zu kontrollieren.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 μl CCK-8-Lösung aus dem Kit und geben Sie sie auf die 96-Well-Zellkulturplatte. In einem CO2 -Inkubator bei 37 °C für weitere 30 min bis 4 h inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption. Verwenden Sie die Dual-Wellenlängen-Messung mit einer Detektionswellenlänge von 430-490 nm und einer Referenzwellenlänge von 600-650 nm.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Feldstärkeintensität für nachfolgende Experimente auf der Grundlage der experimentellen Ergebnisse der Zellproliferation. Wählen Sie Zellen mit guter Proliferation für nachfolgende Experimente aus.</li>
</ol>5. Zell-Scratch-Assay
<ol><li>In jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte werden 3 x 105 Zellen mit einem Gesamtvolumen von 2 ml pro Vertiefung ausgesät. Etwa 72 Stunden später werden die Zellen die Vertiefung abdecken. Führen Sie den Test an der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe getrennt durch.</li>
	<li>Zeichnen Sie mit einer Pipettenspitze eine horizontale Linie am Boden der Kulturvertiefung. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze senkrecht gehalten wird, und versuchen Sie, ein Verkanten zu vermeiden.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Nährmedium und waschen Sie es 2-3 Mal mit PBS.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml serumfreies Medium in jede Vertiefung.</li>
	<li>Stellen Sie die Platte in den 37 °C heißen Inkubator. Nehmen Sie Bilder unter einer vierfachen Vergrößerung des inversen Mikroskops bei 0 h und 24 h auf, um Veränderungen in der Zellmigration zu beobachten.</li>
</ol>6. Immunfluoreszenz
<ol><li>Permeabilisierung der Zellen:<ol><li>Nachdem Sie die Zellsuspensionen vorsichtig in Kulturschalen pipettiert haben, zeichnen Sie mit einem Histologiestift Kreise an den Stellen, an denen die Zellen gleichmäßig auf dem Deckglas verteilt sind. Behandeln Sie die Kontrollgruppe und die verschiedenen Versuchsgruppen getrennt.</li>
		<li>50-100 μl Permeabilisierungs-Arbeitslösung (0,25-0,5 % Triton X-100) zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Dreimal mit PBS waschen für jeweils 5 Minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Serumblockierung: Fügen Sie 3% BSA innerhalb der Kreise hinzu, um das Gewebe gleichmäßig zu bedecken. 30 Minuten bei RT inkubieren.</li>
	<li>Inkubation des Primärantikörpers: Entfernen Sie vorsichtig die Blockierungslösung und geben Sie den entsprechend verdünnten Primärantikörper (aus der Maus, verdünnt bei 1:300) in die Zellvertiefungen. Stellen Sie die Zellkulturplatte in eine feuchte Box und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Inkubation von Sekundärantikörpern: Legen Sie die Zellplatte auf einen Schüttler und waschen Sie sie dreimal für jeweils 5 Minuten. Der entsprechende Sekundärantikörper (CY3-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG, verdünnt bei 1:300) wird zugegeben und 50 Minuten lang bei RT inkubiert.</li>
	<li>DAPI-Kernfärbung:<ol><li>Legen Sie den Deckglas in PBS (pH 7,4) auf einen Shaker und waschen Sie ihn dreimal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Nach dem schonenden Trocknen des Objektträgers wird DAPI-Färbelösung (2 μg/ml, 0,5 mL pro Kreis) in die Kreise gegeben und 10 Minuten lang bei RT in einem dunklen Raum inkubiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage: Legen Sie das Deckglas in PBS (pH 7,4) auf einen Shaker und waschen Sie es dreimal für jeweils 5 Minuten. Nach dem schonenden Trocknen des Objektträgers versiegeln Sie das Deckglas mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium für die Fluoreszenz.</li>
	<li>Bildaufnahme: Anregung von DAPI bei einer Wellenlänge von 330-380 nm und Detektion von Emission bei 420 nm; Anregung bei 465-495 nm und Detektion der Emission bei 515-555 nm für AF488; Anregung bei 510-560 nm und Detektion von Emission bei 590 nm für CY3; Anregung bei 608-648 nm und Detektion von Emission bei 672-712 nm für CY5.</li>
</ol>

Verbesserung der peripheren Nervenregeneration mit nsPEF-stimulierten Schwann-Zellen

<ol>
	<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells.">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li><li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions.">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li><li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration.">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li><li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li><li>Lee, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL/collagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration.">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li><li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields:+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers.">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).</li><li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury.">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li><li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+and+Schwann+cell+partnership+during+nerve+regrowth.">Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+modulates+Schwann+cell+proliferation,+migration+and+differentiation+following+peripheral+nerve+injury.">Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury.</a> J Cell Sci. 132 (6), (2019).</li><li>Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+Schwann+cells+direct+axon+regeneration+within+the+peripheral+nerve+bridge.">Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge.</a> Glia. 69 (2), 235-254 (2021).</li><li>Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcriptional control of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).</li><li>Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+regulates+mitochondrial+oxidative+stress+in+C2C12+myotubes+induced+by+electrical+stimulations+of+different+intensities.">AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).</li><li>Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+pulsed+electric+fields+modulate+cell+function+through+intracellular+signal+transduction+mechanisms.">Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms.</a> Physiol Meas. 25 (4), 1077 (2004).</li><li>Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+single-cell+bioconversion+efficiency+by+harnessing+nanosecond+pulsed+electric+field+processing.">Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing.</a> Biotechnol Adv. 53, 107780 (2021).</li><li>Ruiz-Fern&#225;ndez, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. 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M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+regeneration.">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li><li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+(nsPEF).">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891 (2012).</li><li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth.">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).</li><li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro.">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).</li><li>Ho, T. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels:+Properties+and+applications+in+biomedicine.">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902 (2022).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In den letzten Jahren hat die Anwendung von nsPEF, wie berichtet, ein Schub für das Wachstum erfahren. nsPEF hat eine sehr gezielte Wirkung nur auf den gewünschten Bereich und liefert genügend Energie für die Behandlung, ohne zusätzliche thermische Schäden zu verursachen, was es für den menschlichen Körper sicherer macht28. Diese Eigenschaften geben ihm vielversprechende translationale Aussichten in der Tumorbehandlung und Nervenregeneration. Einige Studien haben jedoch einige Einschränku...

Jedes Jahr sind Millionen von Menschen von Nervenverletzungen betroffen, die sowohl das periphere Nervensystem (PNS) als auch das zentrale Nervensystem (ZNS) betreffen1. Studien haben gezeigt, dass die axonale Reparaturkapazität des ZNS nach Nervenverletzungen recht begrenzt ist, während das PNS aufgrund der signifikanten Plastizität von SCs eine erhöhte Kapazität aufweist2. Dennoch ist die vollständige Regeneration nach Verletzungen peripherer Nerven nach wie vor schwierig und stellt nach wie vor eine erhebliche Herausforderung für die menschliche Gesundheitdar 3,4. Heutzutage sind Autotransplantate trotz der Nachteile der Morbidität an der Spenderstelle und der begrenzten Verfügbarkeit eine gängige Behandlung geblieben5. Diese Situation hat Forscher dazu veranlasst, alternative Therapien zu erforschen, darunter die Materialien6, die molekularen Faktoren7 und die elektrische Stimulation (ES). Als Faktor, der das axonale Wachstum und die Nervenregeneration fördert8, ist die Wahl einer geeigneten Methode der ES und die Erforschung der Beziehung zwischen ES und SC unerlässlich.
SCs sind die wichtigsten Gliazellen des PNS und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regeneration des PNS 9,10. Nach peripheren Nervenverletzungen durchlaufen SCs eine schnelle Aktivierung, eine umfangreiche Reprogrammierung2 und einen Übergang von einem myelinbildenden Zustand zu einer wachstumsfördernden Morphologie, um die Regeneration des Nervsdurchzuführen 2. Eine substantielle Proliferation von SCs tritt am distalen Ende des verletzten Nervs auf, während SCs des distalen Stumpfes eine Proliferation und Dehnung erfahren, um das Bungner-Band zu bilden, das notwendig ist, um Axone zum Wachstum in Richtung des Zielorgans zu leiten11. Darüber hinaus wandern SCs aus den proximalen und distalen Nervenstümpfen in die Nervenbrücke, um SC-Stränge zu bilden, die die Axonregeneration fördern12. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass sich die Synthese und Sekretion relevanter Faktoren, die mit SCs zusammenhängen, bei der peripheren Nervenregeneration ändern, einschließlich der transkriptionellen Faktoren13, der neurotrophen Faktoren14 und der Myelinisierungsregulatoren13. Dies liefert auch Indikatoren für die Beurteilung der Aktivität von SCs. Basierend auf diesen wurde die Förderung der SC-Proliferation, Migration, Synthese und Sekretion relevanter Faktoren zur Verbesserung der peripheren Nervenregeneration umfassend untersucht15.
Frühere Studien haben die Möglichkeit des Einsatzes von ES zur Nervenregeneration gezeigt1. Eine weithin akzeptierte Erklärung ist, dass ES die Depolarisation von Zellmembranen induzieren, das Membranpotenzial verändern und die Funktionen von Membranproteinen beeinflussen kann, indem es die Ladungsverteilungen auf diesen Biomolekülen verändert1. Weit verbreitetes intensives PEF kann jedoch starke Schmerzen, unwillkürliche Muskelkontraktionen und Herzflimmern verursachen8. Es erhöht auch die Aktivität der Kreatinkinase (CK), verringert die Muskelkraft und induziert die Entwicklung von verzögert einsetzendem Muskelkater (DOMS)16. nsPEF ist eine aufstrebende Technik, die Probanden innerhalb einer Nanosekunden-Pulsdauer mit elektrischen Hochspannungsfeldern stimuliert und nach und nach in der Forschung auf zellulärer Ebene eingesetzt wird17,18. Frühere Studien haben berichtet, dass die mögliche Begründung dafür, dass nsPEF die Zellproliferation und Organellenaktivität fördert, die Bildung von Membran-Nanoporen und die Aktivierung von Ionenkanälen ist, was zu einem Anstieg der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration führt19. nsPEF nutzt die Pulsleistungstechnologie, um die Zellmembran aufzuladen und Pulse zu erzeugen, die sich durch kurze Dauer, schnelle Anstiegszeit, hohe Leistung und niedrige Energiedichteauszeichnen 20. Diese Eigenschaften deuten darauf hin, dass nsPEF ein bevorzugter Modus mit minimalen Stimulationsnebenwirkungen sein könnte8. Darüber hinaus bietet nsPEF im Vergleich zu chirurgischen Eingriffen Vorteile wie minimalinvasive Eingriffe, Reversibilität, Anpassbarkeit und Zerstörungsfreiheit des Nervengewebes. Eine Hauptforschungsrichtung von nsPEF im biomedizinischen Bereich ist seine Anwendung für die Ablation von Tumorgewebe unter Verwendung der Stimulation hochenergetischer elektrischer Felder 21,22,23. Einige Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass 12-nsPEF periphere Nerven stimulieren kann, ohne Schäden zu verursachen24. Derzeit gibt es jedoch nur begrenzte Evidenz für die Anwendung von nsPEF im Bereich der Nervenregeneration. Darüber hinaus ist die Stimulation von SCs mit nsPEF ein Pionierversuch, der zu weiterer In-vivo- und klinischer Forschung beiträgt. In dieser Studie wird untersucht, ob die nsPEF-Stimulation von SCs die Nervenregeneration fördern und eine verlässliche Grundlage für nachfolgende vertiefte und systematische Forschungen bieten kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12144-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100 beta Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB14146-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GC305010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-labeled goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB21302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Reagent</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorizing shaker</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>DS-2S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Supply for nsPEF</td>
			<td>Matsusada Precision Inc.</td>
			<td>AU-60P1.6-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochemical pen</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane breaking liquid</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MS6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS powdered</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIKON ECLIPSE C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody</td>
			<td>Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>BS-20563R-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSC96 Schwann cells</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>STCC30007G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanister</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>Pannoramic MIDI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special cable for nsPEF</td>
			<td>Times Microwave Systems</td>
			<td>M17/78-RG217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbine mixer</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regulating schwann cell growth by nanosecond pulsed electric field for peripheral nerve regeneration in vitro

Schwann-Zellen (SCs) sind myelinisierende Zellen des peripheren Nervensystems und spielen eine entscheidende Rolle bei der Regeneration peripherer Nerven. Das Nanosekunden-Puls-Elektrofeld (nsPEF) ist eine aufstrebende Methode, die bei der elektrischen Nervenstimulation anwendbar ist und sich bei der Stimulierung der Zellproliferation und anderer biologischer Prozesse als wirksam erwiesen hat. Mit dem Ziel, zu beurteilen, ob SCs unter nsPEF signifikante Veränderungen erfahren, und um das Potenzial für neue periphere Nervenregenerationsmethoden zu erforschen, wurden kultivierte RSC96-Zellen einer nsPEF-Stimulation bei 5 kV und 10 kV unterzogen, gefolgt von einer fortgesetzten Kultivierung für 3-4 Tage. Anschließend wurden einige relevante Faktoren, die von SCs exprimiert wurden, bewertet, um die erfolgreiche Stimulation zu demonstrieren, einschließlich des spezifischen Markerproteins, des neurotrophen Faktors, des Transkriptionsfaktors und des Myelinisierungsregulators. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, dass nsPEF die Proliferation und Migration von SCs und die Fähigkeit zur Synthese relevanter Faktoren, die positiv zur Regeneration peripherer Nerven beitragen, signifikant verbessert. Gleichzeitig deutete eine geringere Expression von GFAP auf eine gutartige Prognose peripherer Nervenverletzungen hin. All diese Ergebnisse zeigen, dass nsPEF ein großes Potenzial als effiziente Behandlungsmethode für periphere Nervenverletzungen durch Stimulation von SCs hat.

Each year, millions of people are affected by nerve injuries involving both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS)1. Studies have demonstrated that the axonal repair capacity of the CNS is quite limited after nerve injuries, while the PNS shows enhanced capacity due to the significant plasticity of SCs2. Nevertheless, achieving complete regeneration after peripheral nerve injuries remains arduous and continues to pose a significant challenge to human health3,4. Nowadays, autografts have remained a common treatment despite the drawbacks of donor site morbidity and limited availability5. This situation has prompted researchers to explore alternative therapies, including materials6, molecular factors7, and electrical stimulation (ES). As a factor promoting axonal growth and nerve regeneration8, choosing an appropriate method of ES and exploring the relationship between ES and SCs become essential.
SCs are the main glial cells of the PNS, playing a crucial role in the regeneration of the PNS9,10. Following peripheral nerve injuries, SCs undergo rapid activation, extensive reprogramming2,&#160;and transition from a myelin-forming state to a growth-supportive morphology to conduct the regeneration of the nerve2. A substantial proliferation of SCs occurs at the distal end of the injured nerve, while SCs of the distal stump undergo proliferation and elongation to form Bungner&#39;s band, which are necessary to guide axons to grow towards the target organ11. Moreover, SCs from the proximal and distal nerve stumps migrate into the nerve bridge to form SC cords promoting axon regeneration12. Furthermore, previous studies have demonstrated that the synthesis and secretion of relevant factors related to SCs change in cases of peripheral nerve regeneration, including transcriptional factors13, neurotrophic factors14, and myelination regulators13. This also provides indicators for assessing the activity of SCs. Based on these, the promotion of SC proliferation, migration, synthesis, and secretion of relevant factors have been extensively investigated for improving peripheral nerve regeneration15.
Previous studies have demonstrated the possibility of using ES for nerve regeneration1. A widely accepted explanation is that ES can induce depolarization of cell membranes, alter membrane potential, and affect membrane protein functions by changing the charge distributions on these biomolecules1. However, widely applied Intense PEF may cause severe pain, involuntary muscle contractions, and heart fibrillation8. It also increases creatine kinase (CK) activity, decreases muscle strength, and induces the development of delayed onset muscle soreness (DOMS)16. nsPEF is an emerging technique that stimulates test subjects with high-voltage electric fields within a nanosecond pulse duration, and it is gradually being used in cellular-level research17,18. Previous studies have reported that the possible rationale of nsPEF promoting cell proliferation and organelle activity is the formation of membrane nanopores and the activation of ionic channels, which leads to an increase in cytoplasmic Ca2+ concentration19. nsPEF utilizes pulse power technology to charge the cell membrane, producing pulses characterized by short duration, rapid rise time, high power, and low energy density20. These characteristics suggest that nsPEF may be a preferred mode with minimal stimulation side effects8. Furthermore, nsPEF offers advantages such as minimally invasive procedures, reversibility, adjustability, and non-destructiveness to neural tissues compared to surgical interventions. One mainstream research direction of nsPEF in the biomedical field is its application for tumor tissue ablation using high-energy electric field stimulation21,22,23. Some research results indicate that 12-nsPEF can stimulate peripheral nerves without causing damage24. However, at present, there is limited evidence regarding the application of nsPEF in the field of nerve regeneration. Moreover, stimulating SCs using nsPEF is a pioneering attempt, contributing to further in vivo and clinical research. This study explores whether nsPEF stimulation of SCs can promote nerve regeneration and provide a reliable basis for subsequent in-depth and systematic research.

Autor im Rampenlicht: Innovativer Einsatz von nsPEF zur Förderung der Regeneration peripherer Nerven

Regulierung des Schwann-Zellwachstums durch ein gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die periphere Nervenregeneration in vitro

Gepulste elektrische Felder mit geringer Intensität stimulieren die Zellproliferation Dem CCK-8-Assay zufolge war die Proliferationsrate von RSC96 in der 5 kV/cm-Gruppe signifikant schneller als die der Zellen der Kontrollgruppe. Mit zunehmenden Parametern (20 kV/cm und 40 kV/cm) war die Proliferationsrate jedoch instabil und sogar niedriger als die der Kontrollgruppe. Die Zellproliferationsrate von RSC96-Zellen in der 40 kV/cm-Gruppe war signifikant niedriger als in der Kontroll- und der 5 kV/cm-Gru...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Innovative Use of nsPEF to Boost Peripheral Nerve Regeneration at JoVE.com

Hier stellen wir ein Protokoll für die Anwendung eines elektrischen Nanosekunden-Pulsfeldes (nsPEF) zur Stimulation von Schwann-Zellen in vitro vor. Die Synthese- und Sekretionsfähigkeit relevanter Faktoren und Veränderungen des Zellverhaltens bestätigten die erfolgreiche Stimulation mit nsPEF. Die Studie gibt ein positives Bild von der Methode der peripheren Nervenregeneration.

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Förderung der peripheren Nervenregeneration durch nsPEF-stimulierte Schwanenzellen. Wir hoffen, einen neuen Weg zu entwickeln, um Schwanenzellen effizient zu aktivieren, da die Nervenregeneration in den meisten Fällen recht schwierig ist. Wir verwenden auf innovative Weise ein Nanosekunden-postelektrisches Feld nsPEF, um Schwanenzellen zu aktivieren.Wir freuen uns, dass nsPEF ein bevorzugter Modus für die periphere Nervenregeneration mit minimalen Stimulationsnebenwirkungen sein kann. Darüber hinaus bietet unser Protokoll eine verlässliche Grundlage für die anschließende vertiefte und systematische Forschung. Unser Labor wird die Anwendung von nsPEF kontinuierlich untersuchen.Im Hinblick auf die Nervenregeneration werden wir Tiermodelle aufbauen, um In-vivo-Tests zu fördern und die Sicherheit von nsPEF in vivo zu bewerten. Da es nur begrenzte Evidenz für die Anwendung von nsPEF bei der Regeneration von Überweisungsnerven gibt, hoffen wir, dass wir Durchbrüche erzielen können.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

438 Aufrufe.  Zhejiang University. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Förderung der peripheren Nervenregeneration durch nsPEF-stimulierte Schwanenzellen. Wir hoffen, einen neuen Weg zu entwickeln, um Schwanenzellen effizient zu aktivieren, da die Nervenregeneration in den meisten Fällen recht schwierig ist. Wir verwenden auf innovative Weise ein Nanosekunden-postelektrisches Feld nsPEF, um Schwanenzellen zu aktivieren.Wir freuen uns, dass nsPEF ein bevorzugter Modus für die periphere Nervenregeneration mit mi...

Serie: Autor im Rampenlicht: Innovativer Einsatz von nsPEF zur Förderung der Regeneration peripherer Nerven

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse Electric Field (nsPEF) is an emerging method applicable in nerve electrical stimulation that has been demonstrated to be effective in stimulating cell proliferation and other biological processes. Aiming to assess whether SCs undergo significant changes under nsPEF and help explore the potential for new peripheral nerve regeneration methods, cultured RSC96 cells were subjected to nsPEF stimulation at 5 kV and 10 kV, followed by continued cultivation for 3-4 days. Subsequently, some relevant factors expressed by SCs were assessed to demonstrate the successful stimulation, including the specific marker protein, neurotrophic factor, transcription factor, and myelination regulator. The representative results showed that nsPEF significantly enhanced the proliferation and migration of SCs and the ability to synthesize relevant factors that contribute positively to the regeneration of peripheral nerves. Simultaneously, lower expression of GFAP indicated the benign prognosis of peripheral nerve injuries. All these outcomes show that nsPEF has great potential as an efficient treatment method for peripheral nerve injuries by stimulating SCs.

Here, we present a protocol for applying nanosecond pulse electric field (nsPEF) to stimulate Schwann cells in vitro. The synthesis and secretion ability of relevant factors and cell behavior changes validated the successful stimulation using nsPEF. The study gives a positive view of the peripheral nerve regeneration method.