Bu çalışma, Ulusal Anahtar Bilimsel Araç ve Ekipman Geliştirme Projesi (NO.82027803) tarafından finanse edilmiştir.

1. Dondurularak saklanmış RSC96 hücrelerinin çözülmesi
<ol><li>1 mL hücre süspansiyonu içeren kriyoviyalı 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çalkalayarak çözün ve ardından 4-6 mL tam kültür ortamı içeren bir santrifüj tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>3-5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 3 mL tam kültür ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 6-8 mL tam kültür ortamı içeren bir kültür şişesine (veya kabına) ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, mikroskop altında hücre büyümesini ve yoğunluğunu gözlemleyin.</li>
</ol>2. Hücre geçişi:
NOT: Hücre yoğunluğu %80-%90'a ulaşırsa geçişe hazırdır.
<ol><li>Kültür ortamını atın ve hücreleri kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1-2 kez durulayın.</li>
	<li>Kültür şişesine% 0.25 (a / h) tripsin-0.53 mM EDTA ekleyin (bir T25 şişesi için 1-2 mL, bir T75 şişesi için 2-3 mL) ve 37 ° C'de 1-2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Mikroskop altında hücre ayrılmasını gözlemleyin. Hücrelerin çoğu yuvarlaklaşır ve ayrılırsa, şişeyi hızlı bir şekilde çalışma alanına geri koyun, şişeye hafifçe vurun ve sindirimi durdurmak için% 10 FBS içeren 3-4 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>İçeriği karıştırın, çözeltiyi aspire edin ve 1000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve 1-2 mL taze kültür ortamı ekleyerek ve hafifçe pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 1: 2 oranında yeni bir T25 şişesine aktarın ve 7 mL kültür ortamı ekleyin.</li>
</ol>3. nsPEF cihazının çalışması
<ol><li>RSC96 hücrelerini 1 mL DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve her iki tarafta elektrotlar bulunan kolorimetrik çanaklara aktarın.</li>
	<li>Güç anahtarını açın.</li>
	<li>Elektrik alanının yoğunluğunu değiştirmek için cihaz üzerindeki düğmeyi çevirerek parametreleri ayarlayın. Bu çalışmada belirlenen şiddetler 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm ve 40 kV/cm'dir.</li>
	<li>Elektrotları kıvılcımlar görünene kadar dikkatlice döndürün, böylece iki elektrotu hemen ayırmadan önce hücrelerin önceden ayarlanmış alan kuvveti yoğunluklarına göre 5 darbeli nsPEF almasına izin verin. Bu tedaviyi takiben, nsPEF ile muamele edilen deney grubu hücreleri ve tedavi edilmeyen kontrol grubu hücreleri, belirli bir hücre kültürü süresinden sonra (bu deneyde 1 gün) sırasıyla 4-6 bölümlerini gerçekleştirmek üzere alın.</li>
</ol>4. Hücre sayma kiti-8 (CCK-8) testi
<ol><li>Elektrik stimülasyonu ile uyarılan RSC96 hücrelerinden belirli bir konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu hazırlayın. 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. CCK-8 testinin gereklilikleri göz önüne alındığında, reaktif kitindeki toplam hücre sayısını 1 x 103 ile 1 x 106 arasında kontrol edin.</li>
	<li>Kitten 10 μL CCK-8 çözeltisi alın ve 96 oyuklu hücre kültürü plakasına ekleyin. Bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika ila 4 saat daha inkübe edin.</li>
	<li>Emilimi ölçün. 430-490 nm algılama dalga boyu ve 600-650 nm referans dalga boyu ile çift dalga boyu ölçümü kullanın.</li>
	<li>Hücre proliferasyonunun deneysel sonuçlarına dayalı olarak sonraki deneyler için alan kuvveti yoğunluğunu belirleyin. Sonraki deneyler için iyi proliferasyona sahip hücreleri seçin.</li>
</ol>5. Hücre çizik testi
<ol><li>Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda, oyuk başına toplam hacmi 2 mL olan 3 x 105 hücre tohumlayın. Yaklaşık 72 saat sonra hücreler kuyuyu kaplayacaktır. Testi deney ve kontrol grupları üzerinde ayrı ayrı yapın.</li>
	<li>Kültür kuyusunun dibine yatay bir çizgi çizmek için bir pipet ucu kullanın. Pipet ucunun dikey olarak tutulduğundan emin olun ve eğilmesini önlemeye çalışın.</li>
	<li>Kültür ortamını aspire edin ve PBS ile 2-3 kez yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 2 mL serumsuz ortam ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücre göçündeki değişiklikleri gözlemlemek için ters çevrilmiş mikroskobun 0 saat ve 24 saatte dört kat büyütmesi altında fotoğraf çekin.</li>
</ol>6. İmmünofloresan
<ol><li>Hücre geçirgenliği:<ol><li>Hücre süspansiyonlarını kültür kaplarına nazikçe pipetledikten sonra, hücrelerin lamel üzerinde eşit olarak dağıldığı yerlere bir histoloji kalemiyle daireler çizin. Kontrol grubunu ve farklı deney gruplarını ayrı ayrı ele alın.</li>
		<li>50-100 μL geçirgenlik çalışma solüsyonu (% 0.25-0.5 Triton X-100) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin. Her seferinde 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Serum Blokajı: Dokuyu düzgün bir şekilde kaplamak için daireler içinde% 3 BSA ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikor inkübasyonu: Bloke edici çözeltiyi nazikçe çıkarın ve uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikoru (fareden türetilmiş, 1:300'de seyreltilmiş) hücre kuyucuklarına ekleyin. Hücre kültürü plakasını nemli bir kutuya yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>İkincil antikor inkübasyonu: Hücre plakasını bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve her seferinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Karşılık gelen ikincil antikoru (CY3 işaretli keçi anti-fare IgG, 1:300'de seyreltilmiş) ekleyin ve RT'de 50 dakika inkübe edin.</li>
	<li>DAPI nükleer boyama:<ol><li>Lameli PBS'ye (pH 7.4) bir çalkalayıcıya yerleştirin ve her seferinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
		<li>Slaytı nazikçe kuruttuktan sonra, dairelerin içine DAPI boyama solüsyonu (2 μg / mL, daire başına 0.5 mL) ekleyin ve karanlık bir odada 10 dakika RT'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaj: Labeli PBS'ye (pH 7.4) bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve her seferinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Sürgüyü nazikçe kuruttuktan sonra, lamel floresan için solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamıyla kapatın.</li>
	<li>Görüntü elde etme: DAPI'yi 330-380 nm dalga boyunda uyarın ve 420 nm'de emisyonu tespit edin; AF488 için 465-495 nm'de uyarılır ve 515-555 nm'de emisyonu tespit eder; 510-560 nm'de uyarılır ve CY3 için 590 nm'de emisyonu tespit eder; 608-648 nm'de uyarılır ve CY5 için 672-712 nm'de emisyonu tespit eder.</li>
</ol>

nsPOF ile Uyarılan Schwann Hücreleri ile Periferik Sinir Rejenerasyonunun Arttırılması

<ol>
	<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells.">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li><li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions.">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li><li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration.">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li><li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li><li>Lee, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL/collagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration.">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li><li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields:+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers.">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).</li><li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury.">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li><li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+and+Schwann+cell+partnership+during+nerve+regrowth.">Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).</li><li>Yi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+modulates+Schwann+cell+proliferation,+migration+and+differentiation+following+peripheral+nerve+injury.">Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury.</a> J Cell Sci. 132 (6), (2019).</li><li>Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+Schwann+cells+direct+axon+regeneration+within+the+peripheral+nerve+bridge.">Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge.</a> Glia. 69 (2), 235-254 (2021).</li><li>Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcriptional control of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).</li><li>Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+interactions+between+brain-derived+neurotrophic+factor+and+S100&#946;+on+cultured+serotonergic+neurons.">Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100&#946; on cultured serotonergic neurons.</a> Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-sc8+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+by+targeting+EGFR.">miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR.</a> PLoS One. 10 (12), e0145185 (2015).</li><li>Dong, H. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+regulates+mitochondrial+oxidative+stress+in+C2C12+myotubes+induced+by+electrical+stimulations+of+different+intensities.">AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).</li><li>Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+pulsed+electric+fields+modulate+cell+function+through+intracellular+signal+transduction+mechanisms.">Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms.</a> Physiol Meas. 25 (4), 1077 (2004).</li><li>Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+single-cell+bioconversion+efficiency+by+harnessing+nanosecond+pulsed+electric+field+processing.">Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing.</a> Biotechnol Adv. 53, 107780 (2021).</li><li>Ruiz-Fern&#225;ndez, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., N&#250;&#241;ez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF):+Opening+the+biotechnological+Pandora's+box.">Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+nanoelectroablation+therapy+for+basal+cell+carcinoma:+proof+of+method.">First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method.</a> Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-thermal+nanoelectroablation+of+UV-induced+murine+melanomas+stimulates+an+immune+response.">Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).</li><li>Carr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF)+can+affect+membrane+permeabilization+and+cellular+viability+in+a+3D+spheroids+tumor+model.">A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).</li><li>Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+analysis+of+infrared+irradiation-assisted+nanosecond-pulsed+tumor+ablation.">Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation.</a> Sci Rep. 10 (1), 5122 (2020).</li><li>Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+to+enhance+peripheral+nerve+regeneration:+Update+in+molecular+investigations+and+clinical+translation.">Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation.</a> Exp Neurol. 332, 113397 (2020).</li><li>Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -. L., Moore, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+electrical+stimulation+on+nerve+regeneration+following+peripheral+nerve+injury.">The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury.</a> Biomolecules. 12 (12), 1856 (2022).</li><li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+myelination:+relevance+for+development,+injury,+and+demyelinating+disease.">Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease.</a> Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).</li><li>Chen, Z. -. L., Yu, W. -. M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+regeneration.">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li><li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+(nsPEF).">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891 (2012).</li><li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth.">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).</li><li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro.">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).</li><li>Ho, T. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels:+Properties+and+applications+in+biomedicine.">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902 (2022).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Son yıllarda, bildirildiği gibi, nsPEF uygulaması artan bir büyüme yaşadı. nsPEF, yalnızca istenen alan üzerinde yüksek oranda hedeflenmiş bir etkiye sahiptir, ek termal hasara neden olmadan tedavi etmek için yeterli enerji sağlar ve insan vücudu için daha güvenli hale getirir28. Bu özellikler, tümör tedavisinde ve sinir rejenerasyonunda umut verici translasyonel beklentiler sağlar. Bununla birlikte, bazı çalışmalar nsPEF'in bazı sınırlamalarını önermiştir. Malzeme a...

Her yıl milyonlarca insan hem periferik sinir sistemini (PNS) hem de merkezi sinir sistemini (CNS) içeren sinir yaralanmalarından etkilenmektedir1. Çalışmalar, sinir yaralanmalarından sonra CNS'nin aksonal onarım kapasitesinin oldukça sınırlı olduğunu, PNS'nin ise SC'lerin2'nin önemli plastisitesi nedeniyle artmış kapasite gösterdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, periferik sinir yaralanmalarından sonra tam rejenerasyonun sağlanması zorlu olmaya devam etmekte ve insan sağlığı için önemli bir zorluk teşkil etmeye devam etmektedir 3,4. Günümüzde, otogreftler, donör bölge morbiditesinin dezavantajlarına ve sınırlı kullanılabilirliğe rağmen yaygın bir tedavi olmaya devam etmektedir5. Bu durum, araştırmacıları malzeme6, moleküler faktörler7 ve elektriksel stimülasyon (ES) dahil olmak üzere alternatif tedavileri keşfetmeye sevk etti. Aksonal büyümeyi ve sinir rejenerasyonunuteşvik eden bir faktör olarak8, uygun bir ES yönteminin seçilmesi ve ES ile SK'ler arasındaki ilişkinin araştırılması zorunlu hale gelmektedir.
SK'ler, PNS'nin ana glial hücreleridir ve PNS 9,10'un rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynar. Periferik sinir yaralanmalarını takiben, SK'ler hızlı aktivasyona, kapsamlı yeniden programlamaya2 ve sinirinrejenerasyonunu gerçekleştirmek için miyelin oluşturan bir durumdan büyümeyi destekleyici bir morfolojiye geçiş yapar 2. Yaralı sinirin distal ucunda önemli bir SK proliferasyonu meydana gelirken, distal güdük SK'leri, aksonların hedef organa doğru büyümesine rehberlik etmek için gerekli olan Bungner bandını oluşturmak için proliferasyon ve uzamaya uğrar11. Ayrıca, proksimal ve distal sinir güdüklerinden gelen SK'ler, akson rejenerasyonunu destekleyen SC kordonları oluşturmak için sinir köprüsüne göç eder12. Ayrıca, önceki çalışmalar, transkriptiyonel faktörler 13, nörotrofik faktörler14 ve miyelinasyon düzenleyicileri13 dahil olmak üzere periferik sinir rejenerasyonu vakalarında SK'lerle ilgili ilgili faktörlerin sentezi ve sekresyonunundeğiştiğini göstermiştir. Bu aynı zamanda SK'lerin aktivitesini değerlendirmek için göstergeler sağlar. Bunlara dayanarak, periferik sinir rejenerasyonunu iyileştirmek için SK proliferasyonunun, migrasyonunun, sentezinin ve ilgili faktörlerin salgılanmasının teşvik edilmesi kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır15.
Önceki çalışmalar, sinir rejenerasyonu için ES'nin kullanılma olasılığını göstermiştir1. Yaygın olarak kabul edilen bir açıklama, ES'nin hücre zarlarının depolarizasyonunu indükleyebileceği, zar potansiyelini değiştirebileceği ve bu biyomoleküller üzerindeki yük dağılımlarını değiştirerek zar protein fonksiyonlarını etkileyebileceğidir1. Bununla birlikte, yaygın olarak uygulanan Yoğun PEF şiddetli ağrıya, istemsiz kas kasılmalarına ve kalp fibrilasyonuna neden olabilir8. Aynı zamanda kreatin kinaz (CK) aktivitesini arttırır, kas gücünü azaltır ve gecikmiş başlangıçlı kas ağrısı (DOMS) gelişimini indükler16. nsPEF, nanosaniye darbe süresi içinde yüksek voltajlı elektrik alanlarına sahip test deneklerini uyaran gelişmekte olan bir tekniktir ve hücresel düzeydeki araştırmalarda kademeli olarak kullanılmaktadır17,18. Önceki çalışmalar, hücre proliferasyonunu ve organel aktivitesini teşvik eden nsPEF'in olası mantığının, zar nanogözeneklerinin oluşumu ve iyonik kanalların aktivasyonu olduğunu ve bunun da sitoplazmikCa2+ konsantrasyonunda bir artışa yol açtığınıbildirmiştir 19. nsPEF, hücre zarını şarj etmek için darbe gücü teknolojisini kullanır ve kısa süre, hızlı yükselme süresi, yüksek güç ve düşük enerji yoğunluğu20 ile karakterize edilen darbeler üretir. Bu özellikler, nsPEF'in minimum stimülasyon yan etkileri ile tercih edilen bir mod olabileceğini düşündürmektedir8. Ayrıca nsPEF, cerrahi girişimlere göre minimal invaziv işlemler, geri dönüşümlülük, ayarlanabilirlik ve nöral dokulara tahribatsızlık gibi avantajlar sunmaktadır. nsPEF'in biyomedikal alandaki ana araştırma yönlerinden biri, yüksek enerjili elektrik alan stimülasyonu 21,22,23 kullanılarak tümör dokusu ablasyonu için uygulanmasıdır. Bazı araştırma sonuçları, 12-nsPEF'in periferik sinirleri hasara neden olmadan uyarabildiğini göstermektedir24. Bununla birlikte, şu anda, sinir rejenerasyonu alanında nsPEF'in uygulanmasına ilişkin sınırlı kanıt bulunmaktadır. Ayrıca, nsPEF kullanarak SK'leri uyarmak, in vivo ve klinik araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunan öncü bir girişimdir. Bu çalışma, SK'lerin nsPEF stimülasyonunun sinir rejenerasyonunu teşvik edip edemeyeceğini ve sonraki derinlemesine ve sistematik araştırmalar için güvenilir bir temel sağlayıp sağlayamayacağını araştırmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12144-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100 beta Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB14146-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GC305010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-labeled goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB21302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Reagent</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorizing shaker</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>DS-2S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Supply for nsPEF</td>
			<td>Matsusada Precision Inc.</td>
			<td>AU-60P1.6-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochemical pen</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane breaking liquid</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MS6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS powdered</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIKON ECLIPSE C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody</td>
			<td>Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>BS-20563R-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSC96 Schwann cells</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>STCC30007G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanister</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>Pannoramic MIDI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special cable for nsPEF</td>
			<td>Times Microwave Systems</td>
			<td>M17/78-RG217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbine mixer</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regulating schwann cell growth by nanosecond pulsed electric field for peripheral nerve regeneration in vitro

Schwann hücreleri (SK'ler), periferik sinir sisteminin miyelinli hücreleridir ve periferik sinir rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynarlar. Nanosaniye Darbe Elektrik Alanı (nsPEF), hücre proliferasyonunu ve diğer biyolojik süreçleri uyarmada etkili olduğu gösterilmiş, sinir elektriksel stimülasyonunda uygulanabilir yeni ortaya çıkan bir yöntemdir. SK'lerin nsPEF altında önemli değişikliklere uğrayıp uğramadığını değerlendirmek ve yeni periferik sinir rejenerasyon yöntemlerinin potansiyelini keşfetmeye yardımcı olmak amacıyla, kültürlenmiş RSC96 hücreleri 5 kV ve 10 kV'de nsPEF stimülasyonuna tabi tutuldu ve ardından 3-4 gün boyunca ekintiye devam edildi. Daha sonra, spesifik belirteç proteini, nörotrofik faktör, transkripsiyon faktörü ve miyelinasyon regülatörü dahil olmak üzere başarılı stimülasyonu göstermek için SK'ler tarafından ifade edilen bazı ilgili faktörler değerlendirildi. Temsili sonuçlar, nsPEF'in SK'lerin proliferasyonunu ve göçünü ve periferik sinirlerin rejenerasyonuna olumlu katkıda bulunan ilgili faktörleri sentezleme yeteneğini önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Aynı zamanda, GFAP'ın daha düşük ekspresyonu periferik sinir yaralanmalarının benign prognozunu gösterdi. Tüm bu sonuçlar, nsPEF'in SK'leri uyararak periferik sinir yaralanmaları için etkili bir tedavi yöntemi olarak büyük bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Each year, millions of people are affected by nerve injuries involving both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS)1. Studies have demonstrated that the axonal repair capacity of the CNS is quite limited after nerve injuries, while the PNS shows enhanced capacity due to the significant plasticity of SCs2. Nevertheless, achieving complete regeneration after peripheral nerve injuries remains arduous and continues to pose a significant challenge to human health3,4. Nowadays, autografts have remained a common treatment despite the drawbacks of donor site morbidity and limited availability5. This situation has prompted researchers to explore alternative therapies, including materials6, molecular factors7, and electrical stimulation (ES). As a factor promoting axonal growth and nerve regeneration8, choosing an appropriate method of ES and exploring the relationship between ES and SCs become essential.
SCs are the main glial cells of the PNS, playing a crucial role in the regeneration of the PNS9,10. Following peripheral nerve injuries, SCs undergo rapid activation, extensive reprogramming2,&#160;and transition from a myelin-forming state to a growth-supportive morphology to conduct the regeneration of the nerve2. A substantial proliferation of SCs occurs at the distal end of the injured nerve, while SCs of the distal stump undergo proliferation and elongation to form Bungner&#39;s band, which are necessary to guide axons to grow towards the target organ11. Moreover, SCs from the proximal and distal nerve stumps migrate into the nerve bridge to form SC cords promoting axon regeneration12. Furthermore, previous studies have demonstrated that the synthesis and secretion of relevant factors related to SCs change in cases of peripheral nerve regeneration, including transcriptional factors13, neurotrophic factors14, and myelination regulators13. This also provides indicators for assessing the activity of SCs. Based on these, the promotion of SC proliferation, migration, synthesis, and secretion of relevant factors have been extensively investigated for improving peripheral nerve regeneration15.
Previous studies have demonstrated the possibility of using ES for nerve regeneration1. A widely accepted explanation is that ES can induce depolarization of cell membranes, alter membrane potential, and affect membrane protein functions by changing the charge distributions on these biomolecules1. However, widely applied Intense PEF may cause severe pain, involuntary muscle contractions, and heart fibrillation8. It also increases creatine kinase (CK) activity, decreases muscle strength, and induces the development of delayed onset muscle soreness (DOMS)16. nsPEF is an emerging technique that stimulates test subjects with high-voltage electric fields within a nanosecond pulse duration, and it is gradually being used in cellular-level research17,18. Previous studies have reported that the possible rationale of nsPEF promoting cell proliferation and organelle activity is the formation of membrane nanopores and the activation of ionic channels, which leads to an increase in cytoplasmic Ca2+ concentration19. nsPEF utilizes pulse power technology to charge the cell membrane, producing pulses characterized by short duration, rapid rise time, high power, and low energy density20. These characteristics suggest that nsPEF may be a preferred mode with minimal stimulation side effects8. Furthermore, nsPEF offers advantages such as minimally invasive procedures, reversibility, adjustability, and non-destructiveness to neural tissues compared to surgical interventions. One mainstream research direction of nsPEF in the biomedical field is its application for tumor tissue ablation using high-energy electric field stimulation21,22,23. Some research results indicate that 12-nsPEF can stimulate peripheral nerves without causing damage24. However, at present, there is limited evidence regarding the application of nsPEF in the field of nerve regeneration. Moreover, stimulating SCs using nsPEF is a pioneering attempt, contributing to further in vivo and clinical research. This study explores whether nsPEF stimulation of SCs can promote nerve regeneration and provide a reliable basis for subsequent in-depth and systematic research.

Yazar Spotlight: Periferik Sinir Rejenerasyonunu Artırmak için nsPEF'in Yenilikçi Kullanımı

İn Vitro Periferik Sinir Rejenerasyonu için Nanosaniye Darbeli Elektrik Alanı ile Schwann Hücre Büyümesinin Düzenlenmesi

Our research focuses on promoting peripheral nerve regeneration by nsPEF stimulated swan cells. We hope to develop a new way to activate swan cells efficiently as nerve regeneration is quite difficult in most cases. We innovatively use a nanosecond post electric field nsPEF to activate swan cells.We are delighted to find that nsPEF may be a preferred mode for peripheral nerve regeneration with minimal stimulation side effects. Besides our protocol provide a reliable basis for subsequent in depth and systematic research. Our laboratory will continually explore the application of nsPEF.In terms of nerve regeneration, we will build up animal models to promote in vivo testing and evaluate the safety of nsPEF in vivo. As there is limited evidence regarding the application of nsPEF in referral nerve regeneration, we hope we can make breakthroughs.

Düşük yoğunluklu darbeli elektrik alanları hücre proliferasyonunu uyarır CCK-8 testine göre, 5 kV / cm grubundaki RSC96'nın proliferasyon hızı, kontrol grubu hücrelerinden önemli ölçüde daha hızlıydı. Bununla birlikte, parametreler arttıkça (20 kV/cm ve 40 kV/cm), proliferasyon hızı kararsızdı, hatta kontrol grubununkinden bile daha düşüktü. RSC96 hücrelerinin hücre proliferasyon hızı, 40 kV/cm grubunda, kontrol ve 5 kV/cm gruplarından anlamlı derecede düşüktü ve...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Innovative Use of nsPEF to Boost Peripheral Nerve Regeneration at JoVE.com

Burada, Schwann hücrelerini in vitro olarak uyarmak için nanosaniye darbeli elektrik alanı (nsPEF) uygulamak için bir protokol sunuyoruz. İlgili faktörlerin ve hücre davranışı değişikliklerinin sentezi ve salgılanma yeteneği, nsPOF kullanılarak başarılı stimülasyonu doğruladı. Çalışma, periferik sinir rejenerasyon yönteminin olumlu bir görünümünü vermektedir.

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse ...

Araştırmamız, nsPEF ile uyarılmış kuğu hücreleri tarafından periferik sinir rejenerasyonunu teşvik etmeye odaklanmaktadır. Çoğu durumda sinir rejenerasyonu oldukça zor olduğu için kuğu hücrelerini verimli bir şekilde aktive etmek için yeni bir yol geliştirmeyi umuyoruz. Kuğu hücrelerini aktive etmek için yenilikçi bir nanosaniye sonrası elektrik alanı nsPEF kullanıyoruz.nsPEF'in minimal stimülasyon yan etkileri ile periferik sinir rejenerasyonu için tercih edilen bir mod olabileceğini bulmaktan memnuniyet duyuyoruz. Ayrıca, protokolümüz daha sonra derinlemesine ve sistematik araştırmalar için güvenilir bir temel sağlar. Laboratuvarımız sürekli olarak nsPEF uygulamasını araştıracaktır.Sinir rejenerasyonu açısından, in vivo testleri teşvik etmek ve nsPEF'in in vivo güvenliğini değerlendirmek için hayvan modelleri oluşturacağız. Sevk sinir rejenerasyonunda nsPEF'in uygulanmasına ilişkin sınırlı kanıt olduğundan, atılımlar yapabileceğimizi umuyoruz.

regulating-schwann-cell-growth-nanosecond-pulsed-electric-field-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

387 Görüntüleme.  Zhejiang University. Araştırmamız, nsPEF ile uyarılmış kuğu hücreleri tarafından periferik sinir rejenerasyonunu teşvik etmeye odaklanmaktadır. Çoğu durumda sinir rejenerasyonu oldukça zor olduğu için kuğu hücrelerini verimli bir şekilde aktive etmek için yeni bir yol geliştirmeyi umuyoruz. Kuğu hücrelerini aktive etmek için yenilikçi bir nanosaniye sonrası elektrik alanı nsPEF kullanıyoruz.nsPEF'in minimal stimülasyon yan etkileri ile periferik sinir rejenerasyonu için tercih...