Há muito tempo estamos envolvidos na pesquisa de biomateriais, introduzindo o conceito pioneiro de biólogos de materiais em desenvolvimento de vírus, materiais de reparo ósseo ativo e os tecnólogos para fator de crescimento, preparação e ativação. Desenvolvemos uma abordagem In Vivo Osteo-Organoid usando materiais bioativos para alcançar a produção sob demanda de nódulos automáticos, tecidos e células para o tratamento de doenças. A tecnologia tradicional de expansão individual de células-tronco enfrenta limitações na manutenção das funções fisiológicas das células-tronco.
Nosso protocolo constrói um microambiente de culturas individuais para garantir uma quantidade abundante de células-tronco, preservando seu estímulo. Para começar, coloque a solução de estoque humano recombinante e a esponja de gelatina fechada em uma bancada limpa e estéril. Use uma tesoura esterilizada para cortar a esponja de gelatina em 48 pedaços de tamanho uniforme e transfira-os para uma placa de 48 poços.
Pipetar a solução de reserva humana recombinante várias vezes para a misturar bem. Aspire 30 microlitros da solução e adicione-a gota a gota à esponja de gelatina. Em seguida, sele a placa de 48 poços com uma camada de parafilme.
Retire a placa da bancada limpa e coloque-a a uma temperatura de 20 graus Celsius negativos. Para começar, transfira o camundongo anestesiado para a área cirúrgica e posicione-o na posição reclinada lateral direita para facilitar a implantação do andaime bioativo na perna esquerda. Usando uma máquina de barbear, raspe o cabelo da perna esquerda e desinfete a área raspada usando rodadas alternadas de clorexidina e álcool, três vezes cada.
Após fazer a incisão, insira uma tesoura oftálmica no músculo da bolsa na direção da tíbia para fornecer espaço para posterior implantação do material. Agora, pegue o andaime bioativo preparado carregado com humano recombinante e, usando uma pinça oftálmica, aperte-o em uma forma cilíndrica. Implante o andaime na bolsa muscular ao longo da fenda criada anteriormente.
Após 12 semanas de implantação, anestesiar o camundongo e separar cuidadosamente o membro posterior do tronco. Usando uma tesoura em miniatura, remova meticulosamente o tecido muscular dos osteo-organoides. Elimine quaisquer tecidos moles presos usando gaze para garantir uma amostra osteo-organoide limpa.
Fixe uma porção dos osteo-organoides em solução de paraformaldeído a 4% por 24 horas em temperatura ambiente para análise histológica. Para começar, colha osteo-organoides de camundongos implantados com um andaime contendo humanos recombinantes Coloque osteo-organoides em um pilão e adicione um mililitro de HBSS, sem íons de cálcio e magnésio. Use uma tesoura cirúrgica para cortar as amostras e, em seguida, esmague-as suavemente em um pilão.
Passe o resultado em suspensão celular por um filtro de células de 40 micrômetros. Em seguida, centrifugue-o a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois, descarte o sobrenadante.
Ressuspenda os grânulos celulares em 300 microlitros de HBSS e misture bem para obter uma suspensão celular uniforme. Coloque o camundongo anestesiado subletalmente irradiado em uma almofada de aquecimento ajustada a 37 graus Celsius. Depois de garantir a anestesia completa, posicione o mouse em decúbito lateral esquerdo com a cabeça voltada para a direita.
Usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 25, aspire 200 microlitros da suspensão celular preparada. Para expor o olho para o procedimento, coloque um dedo no topo da cabeça e ao longo da linha da mandíbula e puxe suavemente a pele para trás e para baixo. Insira cuidadosamente a agulha com o chanfro voltado para baixo no canto medial do olho em um ângulo aproximado de 30 graus.
Suavemente, siga o contorno do globo ocular com a agulha até atingir a base do olho. Injete a suspensão celular suave e lentamente na área designada. Depois de completar a injeção, retorne o mouse à gaiola para permitir a recuperação.
