Aqui, demonstramos o protocolo de obtenção e preservação das células boas e viáveis para usos de etapas terapêuticas, como a infusão de células mesenquimais pluripotentes. A principal vantagem disso, é que usando esta técnica, podemos obter o volume celular viável versus o tempo ganho na etapa de isolamento das células do tecido coletado. Esta técnica pode ser estendida para todas as doenças ou condições em que a medicina heterogênica e a terapia celular são aplicadas.
Este método também pode ser aplicado a testes de estabilidade citogenômica em áreas como testes de drogas, onde culturas de células de longo prazo podem ser encorajadas. Sempre que manipular as células vivas, seja calmo e confiante. Tome extremo cuidado com a sepse e esteja constantemente alerta com os olhos de um cientista para observar qualquer adversidade e tomar boas decisões.
Comece pesando o saco e medindo a temperatura com um termômetro clínico infravermelho digital sem contato. Deixe o saco por cinco minutos dentro da câmara de fluxo laminar para precipitar as camadas mais gordurosas e separar o tecido que contém as células. Injete 100 mililitros de DPBS com cálcio no saco de transferência e misture-o com as mãos.
Deixe repousar por cinco minutos. Em seguida, use uma seringa de 60 mililitros anexada ao adaptador do saco para descartar a maior parte do líquido basal que precipita. Repita esse processo duas vezes.
Adicione 100 mililitros da solução de digestão ao saco e deixe-o a 37 graus Celsius por 30 minutos sob agitação lenta. Em seguida, transfira todo o conteúdo do saco para quatro tubos cônicos de 50 mililitros e centrifuja-os a 400G por 10 minutos a 22 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e adicione 5 mililitros de DMEM de baixa glicose suplementada com 20% de soro bovino fetal ao pellet celular.
Misture uma solução fresca de 10 microlitros de azul de tripano a 0,05% em água destilada com 10 microlitros de suspensão celular durante cinco minutos. Use um microscópio de luz invertida com ampliação de 20X e conte as células viáveis em uma câmara de contagem de células de Neubauer. Suspenda o pellet celular em um meio crioprotetor a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro.
Em seguida, coloque 1 mililitro desta mistura em frascos criogênicos. Use um recipiente de congelamento com uma taxa de resfriamento de 1 grau Celsius por minuto e armazene a 80 graus Celsius por um ano. Após um ano, armazene-o em caixas de padrão imersas na fase de vapor de nitrogênio líquido.
Os dados das diferentes etapas do procedimento dos nove pacientes são apresentados nesta tabela. De acordo com o rendimento celular inicial, determinou-se um volume variável de células para cada amostra. 1 mililitro de amostras com maior rendimento celular, 1,1 mililitros para amostras com rendimento celular intermediário e 2 mililitros por amostra com menor rendimento celular.
O rendimento celular antes da passagem variou amplamente, mesmo quando a mesma confluência antes da tripsinização foi observada. Portanto, aqui as células podem ter crescido em camadas. A imagem representativa mostra os ADSCs mesenquimais aderentes ao plástico na primeira passagem após o isolamento à microscopia de luz.
As células apresentam adesão à morfologia plástica e fibroblástica. As células viáveis contadas na câmara de Neubauer no ensaio azul de tripano são mostradas aqui. Os dados da citometria de fluxo de seis pacientes são apresentados nesta tabela.
A partir dessas células CD45 negativas, determinou-se a porcentagem de ADSCs com diferentes combinações de marcadores de células-tronco. As imagens representativas mostram a subpopulação de células positivas para marcadores associados a células-tronco na SVF do caso nove após oito meses de criopreservação. Aqui, R1 é a região celular total analisada no gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral.
E R2 é a região negativa CD45. As populações de CD73, CD90 e CD105 são positivas nesta região. A diferenciação de ADSC em condrócitos, osteócitos e adipócitos é mostrada aqui.
Ao tentar este procedimento, lembre-se de mexer lentamente, de preferência com as mãos, deixando a 37 graus Celsius por 30 minutos para observar as aderências e bolhas. Mantenha a temperatura da sala de trabalho em torno de 25 graus Celsius e evite qualquer choque térmico a temperaturas muito maiores. A técnica que mostramos aqui pode ser usada para isolar com sucesso as células mesenquimais pluripotentes de outros tecidos.
