Este produto é otimizado para nivelar proteínas com a etiqueta de proteína de fluorescência e para visualizar a localização e a expressão da proteína de um indivíduo interessante do laboratório de peixe-zebra. É especialmente útil para imagens de proteínas expressas em baixa abundância. Nosso método simplifica e acelera o processo de construção do doador.
Esses componentes, exceto o CDS, são incorporados ao backbone de antemão. O doador também foi otimizado para aumentar a eficiência. O fluxo de trabalho da tela de transmissão acumula núcleo hereditário com o menor custo de tempo e esforço.
O peixe-zebra é o organismo modelo amplamente utilizado em pesquisas sobre infecção e imunidade. Estamos especialmente interessados nos mecanismos subjacentes à sepse. Como agora podemos fazer marcação de fluorescência facilmente usando nosso protocolo, tentaremos rotular uma imagem, proteínas de sepse e células em peixe-zebra.
Para começar, coloque um peixe-zebra fêmea saudável e dois peixes-zebra machos saudáveis em um tanque de acasalamento. Use uma divisória para separar os machos das fêmeas para prepará-los para o acasalamento. No dia da microinjeção, prepare a mistura de microinjeção no gelo em um ambiente livre de RNase.
Usando uma ponta de pipeta sem Rnase, carregue a solução de microinjeção na agulha. Coloque a agulha carregada em um micro manipulador conectado a um micro injetor. Sob um microscópio, use uma pinça pontiaguda para cortar a ponta da agulha, apertando-a suavemente até que ela se quebre.
Ajuste a pressão de injeção até que a agulha ejete consistentemente uma gota de um nanolitro. Em seguida, remova a divisória do tanque de acasalamento e deixe os peixes se reproduzirem por seis minutos. Colete e transfira os embriões de uma célula para uma placa de Petri contendo tampão embrionário.
Examine a saúde dos embriões sob um microscópio óptico e remova ovos ou detritos não fertilizados. Separe 20 embriões saudáveis em uma placa de Petri separada como controles não injetados e rotule a placa. Usando uma escova pequena, transfira e alinhe suavemente embriões saudáveis em estágio de uma célula nas ranhuras de uma placa de microinjeção aquecida à temperatura ambiente.
Remova o excesso de tampão da placa. Com a ajuda de uma ponta de agulha, ajuste suavemente a posição de cada embrião para que o pólo do animal fique voltado para a agulha. Injete um nanolitro da solução misturada no poste do animal.
Após a injeção, enxágue suavemente os embriões em uma placa de 6 poços com tampão de embriões. Coloque a placa em uma incubadora de temperatura constante de 28.5 graus Celsius. 10 horas após a fertilização, examine o desenvolvimento embrionário sob um microscópio estereoscópico e remova os embriões mortos.
24 horas após a fertilização, colete os embriões em tubos de 1,5 mililitro para genotipagem e descarte a água extra com cuidado. Adicione 100 microlitros de tampão de lise contendo Proteinase K a cada tubo. Incube os tubos a 56 graus Celsius por uma hora e depois a 95 graus Celsius por 15 minutos.
Após a incubação, adicione 200 microlitros de etanol e misture bem. Centrifugar o tubo a 19 000 g durante 10 minutos e rejeitar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet com 500 microlitros de etanol a 70%. Centrifugue novamente e seque o pellet ao ar antes de dissolvê-lo em 50 microlitros de água bidestilada
Utilizar um microlitro do extracto para preparar a mistura de reacção para a PCR. Após a PCR, execute géis de agarose com dois microlitros de produtos de PCR para confirmar a amplificação bem-sucedida. Realize a digestão enzimática para avaliar a eficiência dos sgRNAs.
Misture suavemente a solução de digestão e incubada à temperatura ambiente, seguindo as instruções do fabricante. Execute géis de agarose para produtos digeridos juntamente com controles de PCR não digeridos para confirmar a digestão. Para analisar a eficiência do sgRNA, abra o site do TIDE e clique em Iniciar TIDE.
Insira a sequência guia do sgRNA no quadro da sequência guia. Clique em Procurar para carregar o resultado do sequenciamento do controle de tipo selvagem no campo de cromatograma de amostra de controle. Da mesma forma, carregue o resultado do sequenciamento da amostra editada no campo de cromatograma da amostra de teste.
Clique em Atualizar Exibição para analisar os resultados. Para começar, use clonagem independente de ligação ou LIC com exonuclease III para construir o plasmídeo doador. Projete o primer F1 com uma sequência sobreposta com o elemento vetorial 1 e parte do elemento 2.
Projete o primer R2 com uma parte do elemento 1, elemento 2 e elemento 3. Projete o primer F2 para incluir os elementos 3 e 4 e a sequência 5 primos do CDS seguindo o local alvo do sgRNA. Projete o primer R1 com as três sequências primas da sequência de revestimento e uma sequência sobreposta com o vetor.
Use CDNA de peixe-zebra como modelo e execute a PCR com os primers projetados. Purifique os produtos de PCR usando precipitação de etanol. Digerir o vetor doador com enzimas de restrição, como pCI e Acc65I, e purificar o vetor doador digerido.
Quantificar os fragmentos de PCR purificados e o vetor doador digerido usando eletroforese em gel de DNA. Em seguida, prepare a mistura LIC com vetor doador purificado e incube no gelo por 60 minutos. Adicione um microlitro de EDTA 0,5 molar para interromper a reação.
Pipete para cima e para baixo para misturar a solução. Incube a mistura de reação a 60 graus Celsius por cinco minutos. Resfrie os produtos LIC no gelo.
Em seguida, transforme células competentes DH5-Alpha usando produtos LIC. Coloque as células transformadas em placas Luria-Bertani contendo a ampicilina e cultive-as por 16 horas. Após a incubação, escolha colônias únicas das placas LIC para análise de digestão enzimática e sequenciamento de DNA.
Extraia e purifique os plasmídeos doadores corretos com um kit de purificação. Injetar embriões de peixe-zebra com uma mistura de microinjeção para knockin'12 de gene 48 horas após a microinjeção, sob um microscópio de fluorescência estéreo, observar a fluorescência das larvas de peixe-zebra. Usando um método de triagem estabelecido, selecione as larvas fluorescentes e crie-as separadamente.
Com um mês de idade, colete um pequeno pedaço da barbatana de cada peixe-zebra anestesiado em um tubo de PCR rotulado. Coloque o peixe-zebra anestesiado correspondente em uma placa de 6 poços cheia de água filtrada esterilizada por UV que corresponda ao rótulo do tubo. Extraia o DNA genômico usando o método de lise alcalina.
Projete um primer direto a montante do braço de homologia esquerdo e um primer reverso no inserto. Execute PCR, visando a junção de cinco primos da sequência. Examine os embriões F1 obtidos pelo acasalamento do peixe-zebra F rastreado com o peixe-zebra do tipo selvagem para padrões de expressão de GFP.
Genótipar os embriões F1 usando PCR de junção. A fluorescência específica hereditária foi observada nos músculos de todas as progênies F1, indicando a marcação GFP bem-sucedida do conexon 39.9. A fluorescência específica hereditária foi detectada no cristalino de toda a progênie F2, sugerindo marcação mCherry bem-sucedida do conexon 44.1.
O acerto das conexons 39.9 e 44.1 foi verificado por meio de reações em cadeia da junção polimerase.
