Name: peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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Os autores gostariam de reconhecer o financiamento do Japão Agência de Ciência e Tecnologia Investigação exploratória de Tecnologia Avançada (JST-ERATO), a Nova Energia e Tecnologia Industrial Development Organization (NEDO), e do Programa de Promoção da Inovação Estratégica Cross-ministerial (SIP), Japão .

1. Preparação de Formulações Peptide-Based <ol><li> Preparar soluções de estoque de cada péptido como se segue: (KH) 9 -BP100 (1 mg / mL ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) e (BP100) 2 K 8 (70 uM). Pesa-se a quantidade necessária de cada péptido num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar água ultrapura autoclavada para dissolver o péptido. Misturar bem por pipetagem repetida até se obter uma solução límpida. </li><li> Amplificar e purificar o plasmídeo de ADN (pADN), ADN de cadeia dupla (dsDNA) e ARN de cadeia dupla (ARNcd) de acordo com metodologias moleculares padrão. Em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga, fazer soluções de reserva com uma concentração de 1 mg / ml (pADN e dsDNA) ou 400 nM (ARNcd). </li><li> Preparar a solução da proteína com uma concentração de 7 uM, através da dissolução de 1 mg de proteína (por ex., Álcool-desidrogenase, ADH) em pó em 1 ml de solução de carbonato de sódio (0,1 M, pH 9). Marcar a proteína com fsondas luorescent tais como rodamina B (RhB) de acordo com protocolos convencionais para permitir a visualização microscópica da proteína entregue nas células. </li><li> Combinam-se as respectivas componentes num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. <ol><li> Para formulações de péptido-pADN segmentação do citoplasma, adicionar 6,4 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 773.6 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão nuclear (P35S-RLuc-TNOS, Tabela 1). </li><li> Para formulações de péptido-pADN segmentação da mitocôndria, adicionar 6,6 mL de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) a 20 ul de pADN (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C e, em seguida, adicionar 2,4 mL de BP100 (1 mg / ml). Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 256; C, durante mais 15 min. Adicionar 771 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. Utilizar a construção de pADN concebido para expressão mitocondrial (pDONR-COX2: rluc, Tabela 1). </li><li> Para formulações de péptido-dsDNA, adicionar 5,1 mL de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) e 8 ul de ADNcd (1 mg / ml) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 786.9 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li><li> Para formulações de péptido-dsRNA, adicionar 50 ul de (KH) 9 -BP100 (800 nm) para 50 ul de ARNdc (400 nM) e misturar bem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 700 uL de água sem RNase para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li><li> Para formulações de péptido-proteína, adicionar 16 ul de (BP100) 2 K 8 (70 uM) a 16 ul de ADH (7 uM) e misturarbem por pipetagem. Permitir que a mistura se estabilizar durante 15 min a 25 ° C. Adicionar 768 ul de água ultrapura esterilizada para diluir a solução para um volume final de 800 ul. </li></ol></li><li> Permitir que as formulações para estabilizar durante 15 min a 25 ° C. </li></ol> 2. Caracterização das formulações Peptide-Based <ol><li> Transfira cada solução (800 mL) numa cuvete para análise dinâmica de espalhamento de luz (DLS). Determinar o diâmetro hidrodinâmico e polidispersidade índice dos complexos formados com um Nanosizer zeta, usando um 633 nm do laser de He-Ne a 25 ° C com um ângulo de detecção de retrodifusão de 173 °. </li><li> Na sequência de medições de tamanho, transferência de cada solução (800 ul) para uma célula capilar dobrado para medições de potencial zeta em parâmetros padrão de constante dieléctrica, índice de refracção e a viscosidade da água a 25 ° C. </li><li> Observar um pequeno volume da solução do complexo, utilizado para a análise de DLS, por microscopia de força atómica (AFM). Depósito de 10 ul de solução de complexo sobre a superfície recém exposta clivado de uma folha de mica e deixar a mica ao ar durante a noite seca num prato de petri de plástico coberta. </li><li> Adquirir uma imagem dos complexos em ar a 25 ° C, utilizando um braço de suporte de silício com uma constante de 1,3 N / m mola em modo tapping 27,28. </li></ol> 3. A infiltração das folhas das plantas <ol><li> Use plantas cultivadas em solo velhos 3 semana (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou choupo 26). Transfectar pelo menos 3 folhas de servir como triplicado, para a quantificação da expressão de genes ou a entrega de proteína. </li><li> Carregar uma seringa de plástico de 1 ml sem agulha com 100 ul de solução do complexo, para a transfecção de uma folha. Posicionar a ponta da seringa na superfície abaxial da folha. </li><li> Pressione a ponta da seringa contra a folha ligeiramente e pressionar o êmbolo da seringa lentamente enquanto exerce uma contra-pressão com a idedo NDEX de uma mão de látex de luvas do lado oposto. infiltração bem sucedida pode ser observado como o espalhamento de uma área embebido em água na folha. Rotular as folhas infiltradas para facilitar a identificação. </li><li> Incubar a folha transfectado para durações optimizadas seguinte infiltração com péptido-pADN (12 hr), o péptido-dsADN (12 hr), o péptido-ARNcd - formulações (9 48 h) e péptido-proteína (6 h) sob as seguintes condições: 16 luz hr / 8 h escuro, a 22 ° C para A. thaliana e álamo, ou luz constante 24 horas a 29 ° C para N. benthamiana. </li></ol> 4. Avaliação da eficiência de transfecção <ol><li> Extirpar toda a folha transfectadas de plantas menores (por exemplo., A. thaliana) ou uma secção de 1 cm2 da região infiltrada por plantas maiores (por exemplo., N. benthamiana). </li><li> Para as experiências de transfecção utilizando a luciferase da Renilla (Rluc) vector repórter, determinar a transfectioN eficiência quantitativamente usando um Kit de Ensaio Rluc. <ol><li> Colocar cada folha excisada ou secção da folha em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 100 uL de 1 x tampão de ensaio de Rluc lise por tubo. Do mesmo modo, preparar lisados ​​de folhas de controlo não transfectadas (em triplicado). </li><li> Moer a folha usando um pilão de homogeneização e incubar o lisado resultante a 25 ° C durante 6-10 h. </li><li> Centrifugar o lisado a 12.470 x g numa microcentrífuga durante 1 minuto. Transferir 20 uL do ligado clarificado para um poço de uma microplaca de 96 poços, e utilizar o volume remanescente para quantificação da concentração total de proteína usando um kit de ensaio de BCA proteína de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Adicionar 100 ul de 1 × Rluc Assay Substrate (diluídas usando o Tampão de Ensaio Rluc) para o poço e mistura por pipetagem lenta. Coloque a microplaca num leitor de microplacas multimodo e iniciar a medição. </li><li> Subtrair a luminescência de fundo (média do nãoN-transfectadas triplicado) de luminescência de cada amostra experimental. Calcular a proporção de fotoluminescência (unidades de luz relativa, RLU) para a quantidade de proteína (mg). </li></ol></li><li> Para experiências de transfecção utilizando proteína fluorescente (GFP) vector repórter verde ou proteína fluorescente etiquetado (por exemplo., ADH-RhB), observar a fluorescência usando um microscópio confocal de varrimento laser. <ol><li> Corte as bordas de uma folha inteira (para auxiliar a remoção dos espaços de ar), enquanto uma folha em corte pode ser utilizado tal e qual. Retirar o êmbolo de uma seringa de 10 ml e colocar cada secção da folha ou folha excisada na seringa. </li><li> Substituir o êmbolo e empurrá-lo suavemente para o fundo da seringa sem esmagamento da folha. Tirar água para a seringa até que seja cerca de metade cheio. </li><li> Aponte a seringa para cima e empurre o êmbolo para remover o ar da seringa através da ponta. Cobrir a ponta da seringa e puxar lentamente o êmbolo para expelir o ar a partir da Leaf. Repita esse processo várias vezes até que a folha aparece translúcida. </li><li> Cobrir a superfície de uma lâmina de microscópio com fita adesiva. Cortar uma área quadrada na fita suficientemente grande para acomodar a amostra da folha usando uma lâmina, e retire a peça quadrada de fita adesiva com uma pinça para criar uma câmara de amostra. A fita irá servir como um espaçador entre a lâmina e lamela. </li><li> Coloque a folha na câmara com a superfície abaxial para cima e virado para preencher a área da câmara com água restante. Selar a folha no interior da câmara com uma lamela de vidro e para fixar as bordas da lamela com fita adesiva. </li><li> Examine a amostra de folha utilizando o microscópio confocal de varrimento laser sob uma objetiva de 40X ou uma objetiva de imersão 63X de água. GFP ou RhB fluorescência pode ser visualizado em comprimentos de onda de excitação de 488 nm ou 555 nm, respectivamente. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

As etapas críticas no âmbito do protocolo que foram identificados empiricamente são discutidos. Por infiltração seringa, as formulações com base em peptídeos são introduzidos nos espaços aéreos no interior da folha da planta através do estomas. Para garantir a absorção máxima da solução, o processo de infiltração deve ser realizada quando as plantas são sob condições que são favoráveis à abertura estomática isto é., Fornecidas com água suficiente e durante o período de luz. No que diz respeito à preparação de complexos de transfecção, para formulações que envolvem uma combinação de dois péptidos (para entrega de ADN alvo-mitocondrial), a sequência de adição de cada componente é crucial e não deve ser invertido. Existem muitas modificações plausível para o procedimento. Uma outra opção para a infiltração de células vegetais é o uso de infiltração por vácuo, que é capaz de introduzir a solução do complexo em plantas inteiras e / ou parciais, incluindo tecidosmeristemas apicais. Para este procedimento alternativo, as plântulas são submersas na solução de transfecção, e com base na pressão gerada pelo vácuo, os complexos de péptido de transporte de carga são forçados através do estomas e para as células vegetais (Yoshizumi, T., dados não publicados). A expressão do gene transiente, com base em estudos que utilizam células de animais, foi demonstrado que o aumento de concentrações de ADN superiores 29-31. É importante notar que a proporção de péptido de ADN afecta as propriedades biofísicas (tamanho, carga superficial) de complexos (Figura 4), o que influencia a eficiência da transfecção; Assim, a proporção óptima necessita de ser mantida, mesmo com o aumento da concentração de ADN. Uma das principais vantagens em utilizar péptidos como um agente de entrega de genes / proteínas é que a sua sequência é passível de ajuste para cumprir uma função desejada. Por exemplo, o domínio de direccionamento mitocondrial do péptido transportador descrito neste pernoy pode ser substituído por sequências cloroplasmático ou peroxisomais-alvo para localização para essas organelas. Enquanto é possível a transformação de cloroplastos em plantas usando vários biolística 32-34, nem o Agrobacterium, nem o método de biolística poderia introduzir genes para a mitocôndria ou outros organelos além do núcleo (Tabela 2). Não existem limitações rígidas gama de hospedeiros para a transfecção à base de péptido, ao contrário do método baseado Agrobacterium (Tabela 2). Até agora, as formulações para a transfecção de A. thaliana, N. benthamiana e choupo foram optimizados (Tabela 1), mas o método pode também ser aplicado para a Nicotiana tabacum, cultivar tomate Micro-Tom, arroz (com base em experiências preliminares), e outras plantas mono e dicotiledóneas. Como, no entanto, não há nenhuma limitação conhecida no tamanho do transgene quando os péptidos são utilizados umvectores de transfecção. Em contraste, as moléculas de ADN grandes têm sido encontrados para reduzir a eficácia de transformação de Agrobacterium métodos mediados por 35,36, e um limite de tamanho superior para os transgenes de cerca de 200 kb foi avaliado 37-39. Usando biolística, por outro lado, grandes fragmentos de DNA pode ser cortado durante a preparação ou fornecimento em plantas 38. Embora nenhum limite superior tenha sido determinada para a transformação biolística até agora, constrangimentos físicos foram encontrados para restringir o tamanho do DNA que pode ser transferido para muito menos do que 150 kb 40. Os principais benefícios da utilização do sistema à base de péptido para a transferência de genes em comparação com as abordagens actuais funcionem com Agrobacterium ou bombardeamento de microprojécteis, discutidas acima, encontram-se resumidos na Tabela 2. Existem alguns limitações para este método, tal como está. Em primeiro lugar, direcionados entrega de pDNA para organelas específicas, tais como o mitochondria, foi provado ser possível através de uma simples combinação de, sequências de penetração de células e organelas-trânsito se ligam ao DNA, embora a eficiência foi baixa. expressão do transgene pode ser detectada, por microscopia confocal, apenas numa pequena população de mitocôndria dentro das células. Assim, outras modificações são necessárias para: (i) aumentar a translocação de mais complexos através da membrana celular / organelar, e (ii) melhorar a dissociação e a transferência de pADN do péptido transportador para o organelo alvo para expressão. Em segundo lugar, a utilização deste sistema de entrega de ADN, a expressão transiente de genes repórter exógenos foi conseguida com sucesso no compartimento citosólico e mitocondrial de células. incorporação estável e a expressão dos genes introduzidos no genoma nuclear da planta / organelar não tenham sido ainda estabelecido, no entanto, devido à ausência de estratégias de selecção adequados. Embora reconhecendo que existem áreas para melhoria ou mais desenvolvimento, a estratégia de derivados de peptídeo descrito aqui permanece uma técnica simples e versátil, que abriu o caminho para a entrega de várias cargas em diversos tipos de plantas.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml and 10 ml Plastic Syringes</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Plate</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Folded Capillary Cell</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization Pestle</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri Dish</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade and Handle</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Tip Cap</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Uma matriz de cargas de ácidos nucleicos e de proteína foram introduzidas com sucesso em diferentes plantas utilizando os péptidos designados como vectores de entrega. Interacções electrostáticas entre cargas e péptidos catiónicos carregados negativamente, resultou na formação de complexos de transfecção que pode ser directamente infiltrada em folhas de plantas utilizando uma seringa sem agulha (Figura 1). (Formulações optimizadas empiricamente determinadas nestes estudos 21,23-26) para a transfecção de células de planta estão listados na Tabela 1, em que cada tipo de uma vasta gama de cargas entregues (pADN, dsDNA, dsRNA e proteína) é representado. Os diâmetros médios de todas as formulações à base de péptidos estavam no intervalo de aproximadamente 150-300 nm. Com base na análise de DLS, todas as formulações exibida polidispersidades de tamanho relativamente baixos, o que indica que os agregados de carga de péptido-formados têm uma distribuição de tamanho uniforme. As morfologias decomplexos entre o péptido e pADN (Figura 2A) ou proteína (Figura 2B), em mica, foram fotografadas por AFM. globulares complexos homogéneos foram observadas para ambos os combinações peptídicas-pADN e péptido-proteína, de acordo com os dados a partir de medições de DLS. Em termos de potencial zeta de complexos (Tabela 1), pDNA- e complexos dsDNA derivados tiveram cargas de superfície líquida negativa, enquanto complexos baseados em dsRNA tinha uma carga de superfície quase neutro. complexos de péptido-proteína, por outro lado, foram carregados positivamente. As eficiências de peptídeo-pDNA e formulações peptídeo-dsDNA em mediar a transfecção de A. thaliana ou N. benthamiana como sistemas modelo de plantas foram avaliados quantitativamente como qualitativamente. O ensaio de expressão do gene RLuc foi utilizado para a quantificação dos níveis de expressão do gene (Tabela 1), portanto, para este experimento ou pADNdsDNA que codifica o gene RLuc deve ser utilizado para complexação com os respectivos péptidos veiculares. Usando o (KH) 9 -BP100 / pDNA formulação, a entrega e expressão de pADN dirigido ao núcleo pode ser alcançado depois de um período de incubação de 12 h, com uma RLU / mg valor estimado de cerca de 1 x 10 5. Para entrega direccionada-mitocondrial e expressão de ADNp, uma combinação de péptidos, Cytcox- (KH) 9 e BP100, é necessário para a formação do complexo. Com o mesmo período de incubação de 12 h optimizada, no entanto, um nível muito mais baixo de transfecção (aproximadamente 1 x 10 3 RLU / mg) foi atingida. Enquanto isso, foi necessária período similar de incubação (12 h) e nível de expressão do gene (cerca de 1 × 10 3 RLU / mg) / gravadas para complexos baseados em dsDNA, também formulada usando o (KH) 9 -BP100 peptídeo. As avaliações qualitativas da expressão do gene foram realizadas por observação microscópica directa de folhas tratadas com complexos de preparEd usando pADN ou dsDNA que codifica o gene repórter da GFP. Em células transfectadas com complexos não-alvo de péptido-pADN, difundir fluorescência verde correspondente com expressão da GFP era claramente observado e verificou-se localizar no citosol (Figura 3A). diferenças distintas no padrão de localização de fluorescência da GFP foram evidentes nas células infiltradas com complexos de péptido-pADN-alvejado mitocondriais. Aqui, punctata fluorescência verde que colocalize com o corante mitocondrial era visível, confirmando a especificidade da expressão do gene exclusivamente no compartimento mitocondrial de células (Figura 3B). No caso de formulações de péptido-proteína, a conjugação da carga de proteína (ADH) para um fluoróforo (RhB) vai permitir a visualização da proteína entregue no compartimento intracelular. Dentro de um curto período de incubação de 6 horas, foi encontrada a proteína ADH-RhB (azul) para ser distribuído por todoo citosol e vacúolo das células infiltradas (Figura 3C). Enquanto isso, rápida e eficiente a infra-regulação da expressão de genes pode ser realizada em várias plantas que usam formulações de péptido-dsRNA. No primeiro experimento, folha A. thaliana foi infiltrada com peptídeo-dsRNA complexos para silenciar o gene chalcona sintase (CHS), responsável pela antocianina (pigmento vermelho) biossíntese sob condições de seca. A diferença na aparência de A. thaliana, sob as folhas normais (Figura 3D, um) e as condições de seca (Figura 3D, b) proporcionou um meio fácil avaliar CHS silenciamento utilizando a formulação de péptido-ARNcd optimizado (seta 1 indica a região infiltrada). No segundo experimento, os complexos de péptido-dsRNA foram infiltradas nas folhas de transgênicos A. thaliana que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP). Uma redução aparente na expressão YFP poderia ser visto nas células epidérmicas 9 h post-transfecção (Figura 3E, F). A eficácia da formulação na expressão de gene regulador de baixo em planta de um sistema diferente (choupo, 12 h pós-transfecção) foi também verificada (Figura 3G, H). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figura 1: As formulações à base de péptido para a entrega de ácidos nucleicos e Cargas proteína em plantas vivas. Os péptidos transportadores concebidos consistem de policatiões conjugados com penetrante de células ou sequências de trânsito organelares. Policatiões permitem a ligação e / ou cargas de condensação de carga negativa, bem como de escape do compartimento endossomal seguinte internalização em células. A entrega de cargas em células e, subsequentemente, para organelos específicos é mediada por sequências penetrante celulares e sequências de trânsito organelares, respectivamente. Vários cargas que poderiam ser successfully entregue na planta incluem ácidos nucleicos, tais como pADN, ADNcd e ARNcd, bem como proteínas modelo, como albumina de soro bovino (BSA), álcool desidrogenase (ADH) e de citrino (uma variante de proteína fluorescente amarela). Moléculas bioactivas são capazes de formar complexos de transfecção com conjugados peptidicos através de interacções electrostáticas, que são introduzidos em folhas de plantas pela infiltração de uma seringa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figura 2: as morfologias das formulações à base de péptido. (A) AFM amplitude imagem do (KH) 9 -BP100 formulação / pDNA em N / P 0.5. Altura da imagem de AFM de (BP100) 2 K 8 / formulação ADH em rati molar (B)o 10. Reproduzido com a permissão de fontes publicadas 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figura 3: Avaliação da transfecção de microscópico Eficiências utilizando formulações à base de péptido optimizada. (A) a expressão citosólica GFP (verde), claramente distinto da autofluorescência cloroplasto (vermelho), foi observado nas células de mesófilo esponjosos de A. thaliana infiltrada com folhas (KH) 9 formulação -BP100 / pDNA (N / P de 0,5; 12 hr ). (B) a expressão de GFP (verde) foi detectado na mitocôndria (vermelha) nas células da epiderme da folha de A. thaliana infiltrada com Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulação pADN (N / P de 0,5 para cada peptídeoe; 12 h). imagens ampliadas de mitocôndrias com expressão GFP são apresentados no painel da direita extrema. (C) A entrega do ADH-RhB (azul) para as células mesofílicas esponjosos de A. thaliana folhas mediada por (BP100) 2 K 8 a uma razão molar de péptido / proteína de 10, visualizado 6 horas após a infiltração. (D) da folha de A. thaliana antes (a) e após (b) o tratamento com (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 48 h), o que resultou na supressão da via de biossíntese de antocianina. Uma formulação semelhante contendo GFP5 ARNcd foi infiltrada na folha como controlo negativo (c). As setas 1 e 3 indicam a área infiltrada enquanto setas 2 e 4 indicam a área não infiltrada dentro da folha. (E) A. thaliana folhas que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (F) a fluorescência de YFP diminuída seguinte com infiltração<html> (KH) 9 -BP100 / formulação ARNcd (razão molar 2; 9 h). (G) As folhas de choupo transgénicos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) e (H) a diminuição da YFP fluorescência após infiltração com (KH) 9 formulação -BP100 / ARNdc (razão molar 2; 12 h). Reproduzido com permissão de fontes publicadas 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figura 4: Variação de Peptide-to-DNA (N / P) e os efeitos sobre as propriedades biofísicas de complexos. Com o aumento da razão de péptido para ADN, as formulações à base de péptidos diminuir de tamanho, enquanto a sua transição valores de potencial zeta de negativo para positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabela 1: Caracterização e avaliação de várias formulações com base em peptídeos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a> <img alt="mesa 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabela 2: Comparação de tecnologias existentes DNA de entrega baseado em Peptide e outros para plantas intactas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

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Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K visualizações.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Vídeo: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ambiente

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Bioquímica

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Química

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

A célula-célula Assay Transporte Macromoleculares Na Planta Utilizando Bombardeio biobalística

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biologia

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Imunologia e Infecção

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Um método simples para o isolamento de aplicativo para análises de expressão de Gene transiente e protoplastas de soja

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Entrega de moléculas em plantas usando um dispositivo de infusão direta

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

Autor em destaque: dispositivo de infusão direta para entrega de moléculas em plantas  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Dispositivo de Infusão Direta para Entrega de Moléculas em Plantas

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

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