We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

1. Tissue Recolha e Dissection <ol><li> Em cada frasco contendo levedura seca, a cultura 10 adultos do sexo feminino voa com 10 homens para 2-3 dias. Nota: Manter as moscas fêmeas bem alimentados irá melhorar a qualidade global eo rendimento da produção de ovário e facilitar a dissecção. </li><li> Anestesiar a fêmea voa em um dióxido de carbono (CO 2) Voa pad. </li><li> Sob o estereoscópio, colocar várias gotas de meio de RT (meio de Drosophila de Schneider suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS)) em uma almofada de dissecação. Realizar todos os procedimentos de dissecação na média a manter os tecidos vivos e saudáveis. </li><li> Agarrar uma fêmea engordados voar com uma pinça fina de nariz nítidas em seu tórax inferior. Use um outro conjunto de pinça para puxar delicadamente na posterior extremo da mosca até que os tecidos do abdômen estão expostos. Retire os dois ovários de outros tecidos (por exemplo, tripas). Nota: cada ovário exibe uma estrutura opaca que é compord de 16-20 ovarioles anexas. </li><li> Para aumentar a penetração de reagentes, abrir os ovários, puxando-os separados e passando as pontas das pinças em cada ovaríolo entre um par de vezes. Manter as ovarioles ligados dentro de um ovário para minimizar a perda de tecidos durante os seguintes procedimentos. </li><li> Transferir os ovários imediatamente para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS. </li><li> Repita a dissecção e recolher 10-15 ovários em cada tubo de microcentrífuga. </li></ol> 2. EdU Labeling <ol><li> Aspirar o meio em cada tubo, e substituir com 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS contendo 7 ^ M de afidicolina. Nota: A afidicolina é utilizado para bloquear a síntese de ADN nuclear através da inibição da polimerase de ADN α sem afectar a replicação do mtDNA 7, 12. É possível aumentar a concentração acima de afidicolinaa 70 uM para conseguir uma melhor inibição. A solução estoque de afidicolina 3-30 mM em DMSO pode ser armazenada no escuro a -20 ° C durante até 6 semanas. </li><li> Para manter os ovários saudável, garantir que eles estão imersos sob soluções ao mudar o meio. Use meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS até a etapa 2.6. </li><li> Incubar ovários durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador de bancada com rotação suave. <ol><li> Para o tratamento de drogas, por exemplo, cianeto de desacoplador mitocondrial carbonil fenil-hidrazona 4-trifluorometoxi (FCCP), adicionar a concentração apropriada de droga (por exemplo, 10 uM FCCP) para o meio após 2 horas de tratamento com afidicolina. Continuar a incubação durante mais 1 h. </li></ol></li><li> Remover o meio contendo afidicolina com ou sem fármaco. Resumidamente enxaguar os ovários com meio (afidicolina não é necessário) duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de meio contendo 10 uM EdU e 7 | iM de afidicolina e continuar incubating à temperatura ambiente durante 2 h. Guardar a solução estoque de 10 mM EdU (em DMSO) a -20 ° C. </li><li> Remova o meio contendo EdU e afidicolina. Lave com meio (sem afidicolina) duas vezes por 3 min cada um. </li></ol> 3. Tissue Fixação e permeabilização <ol><li> Prepara-se uma solução de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Observação: Usamos comercial disponível paraformaldeído armazenado em ampolas pré-marcados. Abra uma nova ampola e diluir a 4% antes da utilização. CUIDADO: O formaldeído é tóxico; que deve ser manuseado em um exaustor com a pele e proteção para os olhos. </li><li> Fix ovários com 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente com rotação suave. </li><li> Remover o fixador e lava-se duas vezes ovários em 1 ml de BSA a 3% em PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Para permeabilizar as tecidos, remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de 0,5% de Triton X-100 em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Remover a solução de permeabilização e lavar duas vezes em 1 mlde 3% de BSA em PBS. </li></ol> 4. Detecção EdU Nota: EdU detecção baseia-se na química &quot;clique&quot;, Cu (I) catalisada por [3 + 2] cicloadição 13, que adiciona as azidas fluorescentes ao grupo alcino terminal da edu, e a molécula fluorescente é submetida a detecção subsequente. Desde Cu (I), o qual é facilmente oxidado para as espécies não catalíticas de Cu (II), é necessária para catalisar a reacção, recomenda-se reduzir o (II) sulfato de Cu in situ para se obter Cu (I). Isto é, Cu sulfato (II) é utilizado na presença de um redutor tal como o ácido ascórbico (aqui o &quot;tampão aditivo&quot;) para gerar cobre (I). <ol><li> Antes do experimento, preparar a solução de trabalho da azida Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azida, Alexa Fluor 555 azida ou outros, dependendo do fluoróforo preferida, as quais são designadas como &quot;corante azida&quot; daqui em diante), tampão de reacção EdU e tampão EdU aditivo de acordo com o fabricanteinstruções. <ol><li> Reconstituir o corante azida em 70 mL de DMSO. Guardar a solução de trabalho à temperatura de -20 ° C durante até 1 ano. </li><li> Preparar tampão fresco reacção EdU diluindo a EdU tampão 10x reacção com água deionizada. Nota: Após o uso, armazenar qualquer solução 1x restante a 4 ° C. A solução 1x é estável por até 6 meses. </li><li> Faça uma solução 10x estoque do aditivo tampão EdU dissolvendo completamente o pó em 2 mL de água deionizada. Nota: Esta solução é estável durante até 1 ano à temperatura de -20 ° C. Se a solução desenvolve uma cor castanha, que foi degradada e deverá ser descartado. </li></ol></li><li> Prepare o coquetel de reacção EdU fresco de cada vez, e utilizar no prazo de 15 min de preparação. Para obter resultados reprodutíveis, certifique-se os componentes da reacção são mantidas nas mesmas proporções. <ol><li> Adicione fresco 1x tampão EdU solução aditiva por diluição da solução estoque 10x (preparado no passo 4.1.3) 1:10 em água desionizada. Utilize este sOlution no mesmo dia. </li><li> Prepare 1 ml de cocktail EdU reacção através da combinação dos seguintes ingredientes por ordem: 860 ul EdU 1x tampão de reacção, 40 ul de CuSO 4, 2,5 uL de corante de azida, 100 ul de 1x tampão de EdU aditivo. Nota: É importante que os ingredientes são adicionados a fim de assegurar um desempenho óptimo. </li></ol></li><li> Remover o PBS com BSA a 3% e adicionar 0,5 ml do cocktail de reacção EdU a cada tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação suave. Manter as amostras protegidas da luz. </li><li> Remover o cocktail de reacção EdU e lavar uma vez com 1 ml de BSA a 3% em PBS. </li><li> Lavam-se as amostras de uma vez com 1 ml de PBS. </li></ol> 5. Rotulagem de anticorpos Nota: Execute rotulagem de anticorpos após a coloração EdU. Se nenhuma coloração adicional é desejado, pode-se proceder à montagem e de imagem directamente. É importante que as amostras de ser protegida da luz em todos os seguintes procedimentos. <ol><li> Remover a solução de lavagem. Bloquear os ovários em 1 ml de solução de bloqueio contendo 0,2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 30 min. </li><li> Remover a solução de bloqueio e substituir com anticorpo primário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, rato ATP sintase subunidade α anticorpo, diluição 1: 1000). Incubar no escuro a 4 ° CO / N. </li><li> Lavam-se as amostras com 1 ml de solução de bloqueio 3 vezes, 10 min de cada vez. Para minimizar o fundo, lavar mais duas vezes durante 30 minutos cada. Remover a solução de bloqueio. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, anticorpo secundário de cabra anti-rato Alexa Fluor 568, diluição 1: 200) durante 2 horas à TA. Nota: Use uma cor diferente do que acoplado a EdU. </li><li> Repita os passos de lavagem executados no passo 5.3. </li><li> Lavar com 1 ml de PBS uma vez para remover o detergente. </li></ol> 6. Montagem e imagem <ol><li> Remova cuidadosamente todo o PBS e immediately cobrir ovários com 50 ul de meio de montagem (com ou sem DAPI). Nota: Utilizar um meio de montagem que não endurecer enquanto os ovarioles estão a ser separadas umas das outras. Os ovários podem ser armazenadas em meio de montagem, a 4 ° C durante até uma semana. </li><li> Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e usá-lo para transferir ovários cuidadosamente sobre uma lâmina de microscópio. </li><li> Completamente separado cada ovaríolo com uma pinça fina de nariz afiadas sob o microscópio estereoscópico. Remover os tecidos de ligação na extremidade posterior e estágio 14 ou câmaras de ovos maduros. As câmaras de ovo jovens estão na extremidade anterior e transparente. </li><li> Alinhar as câmaras de ovo com uma pinça, para que eles não se sobrepõem uns com os outros. </li><li> Lentamente inferior uma lamela de vidro # 1.5 na parte superior das amostras. Permitir que o meio de montagem para polimerizar durante várias horas à temperatura ambiente. Selo com unha polonês transparente. </li><li> Imagem desliza no dia seguinte, ou armazenar a 4 ° C antes da imagem. </li><li> Visualize sob a mi confocalcroscope com um objetivo de imersão em óleo 63X. Capturar imagens tridimensionais z-pilhas. Nota: Existe uma forte EdU sinalizar na tarde-estágio câmaras de ovos e fluorescência de fundo na bainha epitelial. Ao examinar rotulagem EdU em um germário particular, deve-se evitar germariums que são sobrepostos por ou perto de outros tecidos ou câmaras de ovos em fase posterior. </li></ol>

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	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease.">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).</li><li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis.">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li><li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+fusome,+a+germline-specific+organelle,+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation.">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li><li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis.">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li><li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells.">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex:+an+evaluation+of+the+evidence.">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant.">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li><li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li><li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum.">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li><li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin,+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha.">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li><li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila.">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li><li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila:+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence.">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li><li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila:+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway.">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

EdU rotulagem é um método novo e eficiente para detectar a síntese de DNA em células em proliferação, o que é baseada na incorporação de coloração e de análogos de nucleósidos em ADN recém-sintetizado. Este método é superior para o método de marcação com BrdU na medida em que é mais rápido e altamente sensível. Mais importante, ele permite uma boa preservação estrutural e eficiente penetração EDU-corante de tecidos conjunto de montagem 9, 10. Historicamente, como uma alternativa superior para marcação com BrdU, a rotulagem EdU foi utilizado para estudar a replicação do ADN nuclear durante a fase S do ciclo de célula. A afidicolina é um inibidor de α ADN-polimerase, que é o principal polimerase para a replicação do ADN nuclear em fase S 12 15. replicação mtDNA é realizada por γ ADN-polimerase, que é insensível ao tratamento afidicolina. Assim, o tratamento com afidicolina, antes e durante a incubação EdU inibiu significativamente EdU incorporação no ADN nuclear. Deveria-se notar que a afidicolina possa ser estável durante várias semanas, se apropriadamente armazenada, e a eficácia da afidicolina na inibição da replicação do ADN nuclear foi variável nas nossas mãos. Os ovarioles ou câmaras de ovo com rotulagem DNA nuclear forte devem ser excluídos da análise de novos dados. replicação mtDNA pode ser facilmente visualizado como pontos lacrimais no citoplasma, que também proporciona uma maneira simples para quantificar o nível de replicação do mtDNA por contagem do número de pontos lacrimais EdU, normalizada para o volume total do citoplasma. software de imagem pode ser aplicado para identificar automaticamente EdU pontos lacrimais em imagens microscópicas, o que é especialmente útil para análises computacionais de grandes conjuntos de dados. No entanto, devem ser tomadas precauções, porque a inibição incompleta da replicação do ADN nuclear pode levar à incorporação EdU em loci distintos no cromossoma e exibir como pontos lacrimais dentro do núcleo. Também, em outros casos, a intensidade de incorporação EdU replicando mtDNA pode ser fraca, enquanto o fundo e ruído pode ser alto. Portanto, os parâmetros individuais para análises automáticas de imagem deve ser cuidadosamente definido. Também é recomendado que as imagens devem ser examinadas com os olhos treinados para se certificar de que adequada puncta EdU são identificados. Visualização de mtDNA recém-sintetizado durante Drosophila oogenesis oferece uma oportunidade para investigar como a replicação mtDNA é regulado sob condições fisiológicas ou patológicas, realizando o experimento em moscas sujeitas a uma variedade de perturbações farmacológicas ou genéticas. Em um estudo anterior, ensaio de incorporação EdU foi realizado em uma mtDNA mutante Drosophila mt: CoI T300I 11. Além disso, a perturbar o potencial de membrana mitocondrial, ovários foram tratadas com várias concentrações de FCCP desacoplador mitocondrial ou 2,4-dinitrofenol (DNP), antes da incorporação EdU. Dependendo dos fins experimentaise as características de drogas, pode ser adotado diferentes métodos para a entrega eficaz. Para moscas adultas, as drogas podem ser apresentadas como um vapor (por exemplo, etanol e cocaína) 16,17 drogas ou pode ser injectado no abdómen, onde rapidamente difunde-se por todo o corpo 18. A prática mais comum é que as drogas são adicionados ao alimento ou uma mosca / papel de filtro saturado com a droga sacarose. Por exemplo, o inibidor de montagem de microtúbulos, colchicina, foi alimentada para moscas durante 2-3 dias antes da dissecação do ovário 19. Por isso, é importante para avaliar o método de administração de fármaco e escolher as concentrações apropriadas. Para garantir a imagem de sucesso da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila, vários passos críticos devem ser cuidadosamente executado. Acima de tudo, preservar a viabilidade ea saúde dos ovários durante a dissecção e Edu incorporação é essencial (etapas 1 e 2). O meio de Drosophila de Schneider com FBS precisa de ser aquecida até à TAantes de usar. Deve-se minimizar o contato direto entre as câmaras de ovos e ferramentas de dissecação ou pontas de pipeta. Os ovários deve ser imersa a soluções de todos os tempos para evitar a desidratação. O manuseio incorreto dos tecidos podem facilmente levar a desmaiar ou nenhuns sinais fluorescentes. Durante o passo de montagem do tecido, ovarioles devem ser separados uns dos outros e espalhar-se sobre a lâmina de microscópio. Certifique-se as câmaras de ovos não são empilhados em cima uns dos outros. Notamos que as câmaras de ovos para além fase 14 demonstrou pouca incorporação EdU. Além disso, por causa do tamanho grande, as câmaras de ovos fase tardia, muitas vezes fazer com que os vizinhos câmaras de ovos mais jovens a ficar fora de foco. Assim, recomenda-se que as câmaras de fase final de ovo ser descartado. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a rotulagem replicar mtDNA nos ovários adultos Drosophila. Este método permite a simples quantificação de replicação mtDNA sob várias perturbações genéticas e farmacológicas,e será útil para dissecar os mecanismos subjacentes biogênese mitocondrial desenvolvimento e herança mtDNA.

Além do genoma nuclear, cada célula eucariótica também contém milhares de cópias de DNA circular pequena na matriz mitocondrial. Enquanto DNA mitocondrial (mtDNA) codifica subunidades essenciais da cadeia de transporte de electrões, a maioria do proteoma mitocondrial, incluindo todos os factores de replicação e transcrição de mtDNA são codificados pelo genoma nuclear. Em contraste com o genoma nuclear que segue as leis da hereditariedade mendeliana, o genoma mitocondrial animais é herdado exclusivamente através da linhagem materna. Portanto, compreender como mtDNA é proliferaram e transmitida de uma geração para a outra através do oócito feminino é de fundamental importância. No entanto, há um debate contínuo sobre a forma como a replicação mtDNA é regulada na linha germinativa feminina. Além disso, a teoria gargalo mtDNA amplamente aceites para a transmissão de mtDNA sugere que a população de mtDNA em células germinativas primordiais é sub-amostrado a um número relativamente pequeno durang desenvolvimento 1 2. Implica também que a replicação do mtDNA é temporal e espacialmente regulamentado durante oogenesis. Assim, a detecção in situ de replicação mtDNA durante o desenvolvimento da linha germinativa irá facilitar a compreensão do mecanismo de herança mtDNA. Drosophila oogenesis fornece um sistema geneticamente tratável para estudar a replicação mtDNA e transmissão. Em cada um dos dois ovários de Drosophila, existem 16-20 cadeias independentes de câmaras de ovo chamados ovarioles 3, que são as unidades funcionais de produção de ovos (ver Figura 1A). Cada ovaríolo contém uma organização linear progressiva de oogï¿½ese, onde a ponta anterior é composto de uma estrutura chamada germário. O germário é ainda dividido em quatro regiões que contêm as células germinativas em diferentes estágios de desenvolvimento. Na região 1, as células-tronco germinativas passam por divisão assimétrica para produzir células filhas conhecidos como cystoblasts. Região 2a contém os cistoblastos que tenham concluído a sua divisão final. Cistoblastos sofrer quatro rodadas de grupos de 16 Divisão Celular produzindo. As células 16 permanecem ligadas umas às outras por pontes citoplasmáticas chamados canais de anel. Apenas uma das células compromete-se a diferenciação como o oócito, enquanto o outro 15 desenvolver-se como células poliplóides enfermeira. Uma estrutura citoplasmática essencial, conhecido como fusoma, é proposto para facilitar com a formação de canais de anel, determinar a polaridade cisto e a enfermeira interacções célula-oócitos 4,5. Como os cistos avançar para 2b região, as estruturas de quisto abranger toda a largura do germário, e tornar-se mais associado com as células do folículo. As estruturas germário acabar com a região 3 que contém a primeira câmara de ovo brotamento. Subsequentemente, as câmaras de ovo são montados na extremidade posterior da germário, que progridem através do ovaríolo em 14 etapas morfologicamente distintas. O crescimento do oócito depende das células enfermeira, WHproteínas de transporte ich, mRNA e estruturas endomembrane (por exemplo, de Golgi) através dos canais de anel para o oócito. Durante Drosophila oogï¿½ese, verificou-se que uma fracção de mitocôndrias em cada cisto 16 células foram associados com a fusoma, mudou-se através dos canais de anel e foram entregues no único oócito em uma grande massa chamada Balbiani corpo 6. Este fenômeno foi proposta para contribuir para o controle de qualidade de herança mitocondrial através de ovários femininos. Detecção de síntese mtDNA baseia-se na incorporação de precursores de ADN marcados no ADN celular. Tradicionalmente, um análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) foi utilizado para marcar o mtDNA de replicação em células de cultura de tecidos de 7,8. No entanto, a rotulagem BrdU à base de anticorpo apresenta várias limitações, especialmente para a coloração de tecidos whole-mount. Uma grande desvantagem da marcação com BrdU é que requer a desnaturação do ADN para exporo epitopo de BrdU, de modo que pode ser detectada pelo anticorpo anti-BrdU. A amostra tem que ser tratada sob condições de desnaturação duras, tais como produtos químicos (por exemplo, ácido clorídrico ou misturas de metanol e ácido acético), calor, ou digestão com ADNase, o que poderia interromper a estrutura da amostra e complicam o seguinte procedimento de coloração 9, 10. Aqui, uma alternativa timidina análogo 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) é utilizado para marcar o ADN mitocondrial replicar em ovários adulto de Drosophila. Este método é mais rápido e altamente sensível. EdU é prontamente incorporado no ADN celular durante a replicação do ADN. A detecção que se segue baseia-se numa reacção &quot;clique&quot;, Cu (I) catalisada por reacção covalente entre o grupo alcino terminal e uma azida fluorescente 10. Uma vez que a reacção não requer a desnaturação do espécime, que permite uma boa conservação estrutural. Além disso, o tamanho de um coranteZide só é 1/500 de que uma molécula de anticorpo de 10, o que permite a penetração rápida e eficiente de tecidos conjunto de montagem. Temos utilizado este método para detectar replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis e encontrou um padrão espacial marcante na região germário de Drosophila ovário 11, o que nos levou a propor um mecanismo de herança mtDNA seletiva dependentes de replicação. Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado sobre rotulagem EdU da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila. Para demonstrar a aplicação do protocolo, que também testou a replicação do mtDNA em mtDNA mutante de Drosophila (mt: CoI T300I) 11, bem como com o tratamento de diversas desacopladores mitocondriais, que dissipam o potencial de membrana mitocondrial e, potencialmente, perturbam a replicação do mtDNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0781</td>
			<td>Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ATP synthase subunit &#945; antibody, (15H4C4)</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>Ab14748</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>hts RC</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Elf</td>
			<td></td>
			<td>Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ labeling of mitochondrial dna replication in drosophila adult ovaries by edu staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

O protocolo acima permite a visualização das estruturas puntiformes associados com mitocôndrias (Figura 1B-C), que indicam a replicação do ADN mitocondrial durante a oogénese Drosophila. O ponto lacrimal EdU localizada com mitocôndrias marcadas por coloração para o ATP sintase subunidade alfa (Figura 2). Os sinais observados foram ausentes nos ovários tratados com brometo de etídio 11, um inibidor de replicação de mtDNA 14, validando que estes pontos lacrimais fato etiqueta replicar mtDNA.Aphidicolin foi usada para inibir a coloração do ADN nuclear, sem afectar a replicação do mtDNA (Figura 2). Sem tratamento afidicolina, sinais Edu intensas rotular os núcleos, e mtDNA puncta quase não foram detectados (Figura 3). No entanto, na presença de afidicolina, a incorporação nuclear foi dramaticamente reduzida e foram observados diversos pontos lacrimais associadas com mitocôndrias. (Figura 1B). No entanto, nomeadamente, a replicação do mtDNA exibido um padrão espacial na germário. Como indicado pelo número de pontos lacrimais EdU, há um nível moderado de replicação mtDNA na região 1 do germário, mas quase sem incorporação EDU nas 2A região (Figura 1C). Como o cisto se move para baixo para 2B região na germário, a replicação é retomada mtDNA e o número de pontos lacrimais EdU no quisto posterior da região 2B foi muito maior do que na região 2A (Figura 1C). Especificamente, a incorporação intensiva EdU foi concentrada em torno dos canais de anel e as estruturas fusoma, como manchado pela hu li tai Shao (HTS) proteína. mtDNA mantidos replicando a um nível elevado na região 3 do germário (Figura 1C) Para demonstrar a associação de especigenes ou tratamento com proliferação mtDNA ic, ovários de Drosophila podem ser submetidos a manipulação genética ou tratamento da toxicodependência. Foram tratados ovários com diferentes concentrações de FCCP, um protonophore mitocondrial clássico, que dissipa o potencial de membrana mitocondrial. Como um controlo, DMSO não tinha efeito na replicação do DNA mitocondrial (Figura 4A). Altas doses de FCCP (10 uM) quase esgotada replicação mtDNA inteiramente todo o germário (Figura 4D). No entanto, menor concentração de FCCP (2 ou 5 uM) teve um impacto menor na replicação do mtDNA na região 1 mas a replicação inibida em regiões 2B e 3 (Figura 4B-C), sugerindo que as regiões 2B e 3 são mais sensíveis à ruptura mitocondrial, ou eles mantêm cinéticas de replicação mais lentas relativos. Os resultados acima indicaram que a replicação do mtDNA está associada com a actividade mitocondrial. Particularmente, diferentes regiões do germário responderam diferentemente às imp mitocondrialairment. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figura 1. replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis. (A) Diagrama de um ovaríolo Drosophila e uma visão ampliada da germário. O ovaríolo ilustra da esquerda para a direita, anterior para posterior, estádios de desenvolvimento sucessivos de câmaras de ovos. No germário, o fusoma (vermelho), células-tronco germinativas (azul), mitocôndrias (verdes), oócitos futuro (linha tracejada, reconhecido pelo posicionamento, estrutura fusoma e grupamentos mitocondriais), desenvolvimento de cistos (pêssego) e quatro regiões de desenvolvimento são apresentados . (B) z-projecção pilha representativas de um ovaríolo de tipo selvagem marcado por EDU e o anticorpo contra HTS-RC, um marcador para canais circulares e fusoma. Na presença de afidicolina, a EdU foi incorporado no mtDNA (pontas de setas) e núcleos (setas). Barra de escala, 10 | im.(C) vista ampliada de germaria descritas na região encaixotado B. As quatro regiões de desenvolvimento são indicados. Barra de escala, 5 m 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figura 2. replicação mtDNA na germário Drosophila visualizados por incorporação EdU com o tratamento afidicolina (A) -. Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (D) (verde, b), mitocôndrias, marcada pela ATP sintase subunidade alfa coloração (vermelho, C), e os núcleos, marcado com coloração DAPI (azul, D) com pré-incubação com afidicolina inibidor de ADN polimerase-α. (A &amp;# ;-D 39 &#39;) Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B&#39;), mitocôndria (C &#39;) e núcleos (D&#39;). Na presença de afidicolina, a incorporação nuclear (setas) é reduzido e muitos pontos lacrimais estavam localizados dentro da mitocôndria (pontas de seta). As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figura 3. replicação mtDNA quase não é detectado no germário Drosophila sem tratamento afidicolina (A) - (D). Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (verde), mitocôndrias, marcado porATP sintase coloração subunidade alfa (vermelho), e núcleos, marcado com coloração DAPI (azul) na ausência do inibidor da afidicolina ADN polimerase-α. &#39;Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B (A&#39;-D)&#39;), mitocôndria (C &#39;) e núcleos (D&#39;). Sem afidicolina, etiqueta sinais intensos Edu núcleos (setas), e mtDNA puncta quase não foram detectadas. As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figura 4. mitocondrial desacoplador prejudica a replicação mtDNA. Projectos z-stack representativos mostrando tipo selvagem germário tratado com DMSO(A) ou o desacoplador FCCP mitocondrial em concentrações de 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) durante EdU incorporação. Note-se a marcação auditivos EdU na região 2B tratada com 2 uM FCCP (B), e em ambos 2B região 3 e tratou-se com 5 uM FCCP (descrito em caixas). Quatro regiões de desenvolvimento são mostrados. Flechas, DNA nuclear; pontas de seta, mtDNA. Barra de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

9.0K visualizações.  National Institutes of Health. Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...