Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre telômeros, como a localização do RNA TERRA telomérica de levedura, e posso insistir que é telômero de origem ou em trans, um cromes-mants diferente A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores visualizar moléculas TERRA expressas a partir de um único telômero em células vivas. Demonstrando o procedimento estarão Claudio Oss Pegorar e Nicole Bettin, dois estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar a cultivar células AGS de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, quando as células atingem 50 a 60% de confluência transpect-los com sgRNA Cas9 expressando vetor e o MS2. No dia seguinte substitua o meio de cultivo por meio contendo Neomicina. Depois disso adicione 10 microliters de 0,25% Tripsyn a cada poço de uma placa de 96 poços.
Usando um microscópio e um marcador, marque a posição de cada clone visível no prato. Substitua o meio de cultivo de Neomicina por PBS suficiente para formar uma fina película de líquido nos clones. Usando uma pipeta de 10 microliteres contendo cinco microliters de Trypsin, solte lentamente o Trypsin na colônia.
Permita que a Trypsin desprende as células por um minuto. Raspe a colônia com a ponta, e suge-a na ponta. Depois disso, transfira as células da colônia para um poço da placa do poço 96.
Incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, encha o poço com 150 microliters de meio seletivo. Em seguida, adicione 100 microliters de gelatina a cada poço de três 96 placas de poço.
Incubar as placas em temperatura ambiente por 30 minutos e lavar as placas com PBS duas vezes. Após os clones atingirem 90% de confluência, aspire o meio de cada poço da placa e lave a placa com PBS. Em seguida, adicione 30 microliters de Trypsin a cada poço, e incubar a placa a 37 graus celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione 70 microliters de meio seletivo a cada um dos poços. Interrompa as células se escoando para cima e para baixo. Transfira 30 microliters da mistura para o poço da placa de DNA gelatinizada contendo 120 microliters de meio seletivo.
Em seguida, transfira 30 microliters da mistura para a placa de congelamento gelatinizada contendo 50 microliters de médio. Coloque o DNA na incubadora, e permita que as células cresçam a 37 graus celsius até atingirem 90% de confluência. Depois disso, adicione 80 microliters de gelo frio congelando médio para cada poço da placa de congelamento.
Sele a placa com parafilm, substitua a tampa e enrole a placa em papel alumínio. Em seguida, mantenha as placas de congelamento a 80 graus celsius. Depois que os clones na placa de DNA atingirem 90% de confluência, lave a placa com PBS duas vezes.
Em seguida, lise as células com 50 microliters de tampão de lysis. Cubra a placa com parafilm, substitua a tampa e enrole a placa em envoltório saran. Depois disso, incubar a placa a 37 graus celsius durante a noite.
No dia seguinte, adicione 100 microliters de solução de cloreto de sódio etanol a cada poço, e permita a precipitação de DNA por seis horas ou durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, inverta a placa e lave-a três vezes com 200 microliters de etanol 70% por poço. Adicione 20 microliters de RNase Uma solução a cada poço da placa, e incubar a placa a 37 graus celsius por uma hora.
Depois disso, use três microliters de DNA genômico para amplificação pcr, e configure a máquina PCR. Cresça os clones positivos do PCR em seis placas de poço de acordo com o protocolo de texto. Uma vez que os clones atinjam 90% de confluência, lave as células com PBS, e adicione 250 microliters de tampão de lysis com Proteinase K em cada poço.
Use um raspador de células para raspar as células e transfira o Lysate para um tubo de 1,5 mililitro. Incubar o Lysate a 37 graus celsius por 16 horas. Adicione um mililitro de etanol ao Lysate, e agite vigorosamente.
Permita que os clones cresçam em meio F-12K de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione o adenovírus expresso em Cre às células assim que atingirem 70% de confluência. 48 horas após a infecção, divida as células em três pratos de 10 centímetros.
Em seguida, cultura os terceiros pratos para congelamento celular, e extração de RNA. Primeiro, emplaque os clones TERRA-MS2 e as células AGS do tipo selvagem em pratos de fundo de vidro. Em seguida, adicione Polybrene e o MS2-GFP expressando retrovírus ao meio.
Após 24 horas descarte o meio contendo o retrovírus e adicione meio fresco sem fenol vermelho às células. Finalmente, usando um microscópio invertido e uma imagem sensível da câmera as células com o objetivo e abertura apropriados. Neste protocolo, clones de células cancerígenas contendo uma sequência MS2 em um único subtelomere foram criados e imagens.
Os clones resistentes à Neomicina foram rastreados usando PCR. Os clones positivos foram cultivados em lysed para extração genômica de DNA e análise de manchas do sul. Os clones positivos para a análise de PCR e manchas do Sul foram infectados com o CRE-GFP expressando Adenovírus, a fim de remover o gene Neomicina presente no MS2.
Uma vez confirmada a eliminação do gene de resistência à neomicina, o RNA extraído dos clones foi testado para a expressão de transcrições TERRA-MS2. A fim de visualizar as transcrições TERRA-MS2 em células vivas por microscopia confocal, os clones selecionados foram infectados com um retrovírus expressando uma proteína de fusão MS2-GFP. As transcrições e telômeros TERRA-MS2 foram visualizados simultaneamente em células vivas por meio de microscopia confocal, co-expressando a proteína de fusão MS2-GFP e uma proteína de ligação de telômero fundido mCherry, TRF2, nos clones selecionados.
Ao tentar este procedimento é importante fazer todos os esforços para selecionar um único clone em vez de uma população mista de clones. Após este procedimento, outros métodos como um PEIXE DE DNA em spreads de cromossomo, podem ser usados para visualizar a integração do MS2 em células fixas. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores do campo dos telômeros explorarem a localização celular de moléculas de simples telomere TERRA em células humanas vivas.
Não se esqueça que trabalhar com vetores virais e materiais radioativos pode ser extremamente incerto. E precauções, como usar jalecos, luvas e usar escudos de plexiglass para minimizar a radiação devem ser sempre tomadas na realização deste procedimento.
