Nossa pesquisa busca entender os mecanismos imunológicos subjacentes à patogênese da fibrose pulmonar. Um dos maiores desafios no campo continua sendo traduzir modelos in vitro e in vivo para fibrose pulmonar humana. Existem vários modelos animais para estudar a fibrose pulmonar.
Procuramos padronizar um dos modelos mais comumente usados, o modelo murino de bleomicina, para que seja facilmente adaptável para uso de outros laboratórios. Apresentamos um método minimamente invasivo, altamente reprodutível e seguro de administração de bleomicina no modelo murino de fibrose pulmonar. Este modelo animal complementa in vitro em estudos humanos.
Envolve a execução dos tipos de células críticas para a patogênese e replica fisiologicamente as mudanças na ventilação, perfusão e troca gasosa que ocorrem durante a lesão. Prevemos que intervenções que reduzam severamente a gravidade histopatológica in vivo podem indicar melhores resultados clínicos. Prossiga para preparar soluções de bleomicina em uma capa química, seguindo as devidas precauções quimioterápicas.
Primeiro dissolva o pó de bleomicina em PBS estéril para preparar uma concentração de estoque de 10 unidades por mililitro. Dependendo da bleomicina específica usada e do objetivo experimental, prepare a concentração final de trabalho de acordo com a dose necessária com base no peso corporal. Para ajustar o volume final de administração, diluir a bleomicina para 0,375 unidades por mililitro, garantindo um volume total de 50 mililitros para um camundongo de 25 gramas.
Suspenda o mouse devidamente anestesiado na plataforma de procedimento em um ângulo de 60 a 80 graus, pendurando-o pelos incisivos frontais para abrir efetivamente a orofaringe. Oclua a passagem nasal usando um grampo microvascular liso para forçar a respiração através da orofaringe. Usando uma pinça, retraia a língua para fora da orofaringe.
Usando uma pipeta de passo com uma ponta de isca de topo, coloque suavemente o volume desejado de bleomicina ou controle salino na parte de trás da orofaringe. Certifique-se de que uma bolha visível de líquido seja grosseiramente aparente. Continue segurando a língua no lugar até que o mouse aspire a solução, que é visível e muitas vezes audivelmente aparente.
Assim que a aspiração for confirmada, remova cuidadosamente o clipe nasal. Observe o mouse na posição suspensa por 15 segundos para garantir que não haja refluxo da solução de bleomicina antes de devolvê-lo à sua gaiola. Em seguida, coloque o animal de lado em sua gaiola com uma almofada de aquecimento embaixo para manter a neutralidade térmica.
Aperte suavemente os dedos dos pés e certifique-se de que os animais permaneçam eutérmicos para facilitar o despertar. Monitore os camundongos até que eles recuperem a consciência total, o que normalmente leva de uma a duas horas, dependendo da dose de cetamina e do tamanho e metabolismo do animal. Monitore clinicamente os camundongos diariamente quanto a alterações no peso corporal, higiene, nível de atividade e estado respiratório.
Acompanhe o peso como um marcador chave da eficácia do modelo. No momento apropriado, colha os pulmões dos camundongos devidamente sacrificados. Para histologia, dissecar os pulmões em bloco e fixá-los em paraformaldeído a 4% por 24 horas.
Prossiga com a inclusão, seccionamento e coloração de parafina usando hematoxilina e eosina ou tricrômico de Masson. Para medição de colágeno solúvel, homogeneizar o pulmão direito. Para citometria de fluxo, digerir o pulmão direito usando um dissociador de tecido e uma solução enzimática para obter uma suspensão de célula única.
Realize coloração e análise de citometria de fluxo seguindo protocolos padrão. Em comparação com o controle PBS, alterações fibróticas nos septos alveolares e pequenas áreas inflamatórias ou fibróticas foram observadas em amostras de pulmão tratadas com bleomicina no sétimo dia. No dia 14, regiões fibróticas maiores e mais confluentes apareceram com destruição significativa da arquitetura alveolar normal.
No dia 21, as alterações fibróticas persistiram sem aumento mais significativo. O sistema de pontuação de Ashcroft modificado confirmou que os níveis de fibrose foram semelhantes entre os dias 14 e 21. Os ensaios de hidroxiprolina realizados no dia 14 demonstraram um aumento no conteúdo de colágeno solúvel total nos pulmões tratados com bleomicina em comparação com o controle.
A análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase mostrou uma regulação positiva dos genes pró-fibróticos Col1A1 e TGFB em resposta à bleomicina. A análise por citometria de fluxo revelou uma infiltração robusta de células mieloides, incluindo macrófagos intersticiais, macrófagos alveolares derivados de monócitos e neutrófilos nos pulmões.
