Agradecemos a Cystic Fibrosis Foundation (CFF) para o financiamento deste trabalho através da sua Consórcio Estrutura CFTR 3D (subvenção número FORD08XX0). Reconhecemos a enorme contribuição de todos os nossos colegas dentro do Consórcio para este trabalho, em particular na concepção dos genes CFTR. Agradecemos também as valiosas contribuições dos drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Grécia), Mark Young (Universidade de Cardiff, Reino Unido) e David Drew (Imperial College, Londres, Reino Unido) nos estágios iniciais do trabalho. Agradecemos especialmente a Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) para a leitura crítica do manuscrito.

1. Preparação de Mídia e amortecedores <ol><li> YNB: Para um litro, suspender 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos e 0,77 g de mistura suplemento completo sem uracilo em 1 L de água. Autoclave. Armazenar a 4 ° C. </li><li> YNBA: Para 400 ml, suspensão 2,76 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 0,38 g mistura suplemento completo sem uracilo e ágar 8g bacteriológico em 350 ml de água. Autoclave. Misturar 8 g de glicose com 50 ml de água e aquecer suavemente até à dissolução. Esterilizar por meio de um filtro de 0,2 uM e adicionar à YNBA, enquanto que o agar é fundido. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> Médio glicose a 20%: Para 500 ml, misturar 100 g de glicose com 500 ml YNB e aquecer suavemente até à dissolução. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> Galactose médio de 20%: Para 2 litros, misture 400 g com galactose YNB 2l e aquecer lentamente até dissolver. Filtrar através de um filtro de 0,2 uM para uma garrafa de Duran estéril. Guarde-o em sala de temperamentotura. </li><li> Protease ações inibidoras: CFTR é altamente suscetível à proteólise 4. Os autores encontraram os seguintes inibidores para ser eficaz em limitar a proteólise, embora os leitores podem querer adaptar esta lista para atender suas próprias necessidades. Armazenar em alíquotas de 100 ul a -20 ° C para reduzir os problemas de congelação-descongelação. Todos os inibidores da devem ser diluídas a partir das soluções-mãe para a concentração de trabalho como abaixo: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Inibidor </td><td> Concentração estoque </td><td> Preparação estoque </td><td> Concentração de trabalho </td></tr><tr><td> AEBSF </td><td> 200 mM </td><td> Dissolver 48 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Benzamidina </td><td> 300 mM </td><td> Dissolver 36 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 0,3 mM </td></tr><tr><td> Quimostatina </td><td> 4 mM </td><td> Dissolve-se 2,5 mg em 1 ml de DM secoSO </td><td> 4 mm </td></tr><tr><td> E 64- </td><td> 7 mM </td><td> Dissolver 2,5 mg em água destilada 1 ml </td><td> 7 mM </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> 20 mM </td><td> Dissolver 10 mg em 1 ml de água destilada </td><td> 20 uM </td></tr><tr><td> Pepstatina A </td><td> 15 mM </td><td> Dissolve-se 10 mg em 1 ml de DMSO seco </td><td> 15 uM </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 1 M </td><td> Dissolve-se 174mg em 1 ml de DMSO seco </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> DTT (1 M): Dissolver 154 mg de ditiotreitol em água destilada 1 ml. Armazenar a -20 ° C. Use por diluição 1:1000 em tampões indicados. </li><li> EDTA (0,5 M): mistura de 29,22 g de ácido etilenodiaminotetracético com 100 ml de água. Adicionar gota a gota NaOH 10 N até todo o EDTA tem dissolvido e que o pH atinja 8. Perfaz-se a 200 ml com água e passar através de um filtro de 0,2 um para um frasco estéril Duran. Armazene à temperatura ambiente. </li><li> CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M de sorbitol, EDTA 1 mM): Dissolver 18,17 g de Tris-base em 350 ml de água e ajustar o pH a 7,4 por adição de HCl. Adicionar 51,35 g de sorbitol e fazer o volume até 500 ml com água. Autoclave. Adicionar 1 ml de solução stock de EDTA e armazenar a 4 ° C. </li><li> CFTR tampão (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glicerol): Dissolver 6,06 g de Tris-base em 500 ml de água. Ajustar o pH a 8 com HCl, adicionar 100 ml de glicerol e perfazer a 1 L com água. Autoclave e armazenar a 4 ° C. </li><li> 2x corante de carga: 50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), glicerol 5%, EDTA 5 mM (pH 8,0), 0,02% de azul de bromofenol, SDS 4%, 0,05 M DTT. Faça alíquota de 10 ml, e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Os transformantes de triagem Este protocolo assume que o gene de fusão CFTR-GFP-8His foi inserido a jusante de um plasmídeo de levedura a um promotor GAL1 galactose (Fig.1) e que o plasmídeo foi transformado em células FGY217, uma deleção PEP4 mutante de S. cerevisiae 10 </em&gt;. As células podem ser cultivadas em placas de YNBA e armazenada durante várias semanas a 4 ° C. Para armazenamento a longo prazo, as unidades de glicerol deve ser feita, e armazenadas a -80 ° C. Métodos para a clonagem e transformação são descritos em detalhe por Drew et al. (2008) 10. <ol><li> Escolha 5-10 bem separados colónias de uma placa de transformação. Transfira cada colónia para um separada 50 ml estéril tubo Falcon contendo 9 ml YNB e 1 ml de meio de glicose a 20%. Para esta etapa, é importante ter uma concentração final de glicose a 2% (w / v) na cultura para manter o crescimento celular. Crescer durante a noite durante 16 horas a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação. </li><li> As existências de glicerol para cada uma das colónias filtrados. Adicionar assepticamente 0,8 ml das culturas durante a noite para 0,2 ml de glicerol estéril em rotulados parafuso-top frascos, brevemente vórtice e armazenar a -80 ° C. </li><li> Diluir as culturas restantes durante a noite para um volume final de 50 ml em YNB, incluindo 250 uL de meio de glicose a 20%.Para esta etapa, é importante para diluir a concentração de glucose a cerca de 0,1% (w / w) na cultura porque glucose elevada pode reprimir o promotor GAL1 10. Crescer culturas em rotulada 250 ml de Erlenmeyer confundido frascos para um OD 600 de 0,7-0,8 a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação. </li><li> Induzir as culturas por adição de 5 ml médio galactose a 20% em cada balão e crescer em durante 16 horas. </li><li> Confirmar a expressão de CFTR usando microscopia de fluorescência. Tome 100 ul de cultura e adicionar 100 uL de glicerol para limitar a mobilidade de células em solução. Analisar as células de uma RT Visão Delta microscópio restauração (ou semelhante), usando um laser azul sob um filtro FITC (comprimento de onda de excitação de 490 nm e comprimento de onda de emissão de 528-538 nm). Expressão positiva da proteína de fusão CFTR-GFP deve ser visível como um anel de fluorescência na membrana plasmática das células de levedura. Células de levedura não transformadas pode ser utilizado como um controlo. </li><li> Transferir oculturas em tubos Falcon de 50ml. Colher as células por centrifugação a 3500 xg, 4 ° C durante 10 minutos numa centrífuga de bancada. Enquanto a centrífuga está em execução, preparar tubos de microcentrífuga 2 ml com tampa de rosca contendo aproximadamente 500 ul contas ácido-lavadas de vidro e colocar no gelo. Descartar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 500-800 CRB gelada ul com inibidores da protease. Transferir as suspensões para os tubos de microcentrífuga contendo as pérolas e manter em gelo. </li><li> Lisar as células por vigorosamente agitação / vortex cada tubo de microcentrífuga durante 10 períodos de 30 segundos, repousando sobre gelo entre períodos. Um beadbeater pode ser empregue como uma alternativa, por exemplo, uma mini-BioSpec beadbeater operado durante 3 min. </li><li> Colocar os tubos em um de microcentrífuga de bancada e centrifugar a 3500 xg, 4 ° C durante 5 minutos. Transfira os sobrenadantes contendo a população de membrana em bruto para limpar tubos de microcentrífuga e colocar em gelo. Adicionar 500 ul fresco gelo co-ld CRB com inibidores de protease a cada tubo e repetir o processo para acumular as membranas. </li><li> Recolher as membranas em bruto por fiação à velocidade máxima, 4 ° C numa microcentrífuga de bancada durante 2 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cada 50 uL de tampão CFTR gelada. </li><li> Em tubos de microcentrífuga limpas, misturar 15 ul de cada suspensão com 15 corante carga ul 2x por pipetagem cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Não ferver as amostras, como isso fará com que as proteínas da membrana CFTR e outro para formar agregados insolúveis SDS-e também desnaturar a marca GFP. </li><li> Carregar as amostras, juntamente com padrões proteicos PageRuler Além disso prestained (Fermentas) para um 4-20% de Tris / glicina em gel com gradiente (NuSep) e executar a 150 V durante 40 minutos ou até que a frente de corante-se na parte inferior do gel. </li><li> Identificar os mais elevados por células que expressam em gel de fluorescência. Coloque em um sistema de imagens de fluorescência, como um scanner Typhoon. Digitalizar o u gelcantar o laser azul em um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 526 nm. A fusão CFTR-GFP deve ser visível a cerca de 220 kDa. Haverá também uma banda fraca fluorescente visível a cerca de 70 kDa que é provavelmente uma levedura intrínseca FAD contendo proteína de membrana (tal como succinato desidrogenase subunidade A) 11,12. </li><li> Corar o gel com Coomassie, destain e digitalizar o gel para comparação com a verificação de fluorescência usando um pacote de software conveniente imagem de visualização. O gel corado com Coomassie permite uma avaliação relativa dos níveis de CFTR-GFP de expressão em diferentes linhas clonais após normalização para a quantidade de proteína total foram carregados em cada faixa do gel. </li><li> Streak a linha celular mais alta expressão de seu estoque de glicerol (2,2) em um YNBA fresco placa e incubar a 30 ° C durante 2-3 dias. Esta placa pode então ser armazenado por até 2 semanas a 4 ° C. </li></ol> 3. Em larga escala Cult Fermenterure <ol><li> Preparar pré-culturas para o fermentador. Raspe uma área de 2 1cm de células do YNBA placa (2,13), utilizando uma agulha esterilizada e adicionar a 45 ml YNB e 5 ml de meio de glicose a 20%, de tal modo que o OD 600 é de aproximadamente 0,1. Crescer em balões de 250 ml de Erlenmeyer confundiu a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1. </li><li> Dividir a cultura entre dois 2 l Erlenmeyer confundido balões contendo cada uma 450 ml YNB e 25 ml de meio de glicose a 20%. Crescer estas sobre a 250 rpm, 30 ° C em um incubador orbital agitação até a DO 600 atinge 1,2. </li><li> Embora estas culturas pré-estão crescendo, configurar o fermentador. Fazer 11.2l de YNB como descrito em 1.1, mas dissolver um adicional 8,28 g YNB e 0,95 g gota fora suplemento para compensar a adição de glicerol na indução. Assepticamente adicionar a 11,2 l YNB e 75 ml de meio de glucose de 20% a um vaso fermentador estéril 20L e ajustar a temperatura de funcionamento para30 ° C. </li><li> Assepticamente adicionar os precultura para o fermentador e definir a velocidade de agitação a cerca de 800 rpm e manter a temperatura a 30 ° C. O ar comprimido deve fluir em aproximadamente 15 dm 3 min -1. Uma vez que a cultura atinge um fermentador de OD 600 de 1,2, induzir, assepticamente, a adição de 1,5 l YNB solução de galactose a 20% e 1,2 glicerol l. Reduzir a temperatura a 25 ° C e crescer a cultura durante 16 horas. </li><li> Transferir o conteúdo do fermentador em potes de centrífuga refrigerada 1l sobre gelo utilizando uma bomba peristáltica. Colher as células por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 30 minutos num rotor de grande capacidade (por exemplo, 6 litros). Ressuspender as células em 150 ml de gelo CRB frio com inibidores de protease. Daqui em diante, todo o trabalho deve ser realizado a 4 ° C. </li><li> Lisar as células por passagem através de um disruptor Constante sistemas de células em 4 passagens em 25, 30, 32 e 35 kPa, recolhendo o lisado em gelo, em cada caso. Em alternativa, usar um talão beater (Biospec) com um volume igual de ácido-esferas de vidro lavadas 0,5 mm e agitar durante 3 minutos na potência máxima. Transferir o lisado de 50ml Falcon tubos e pellet os restos celulares por centrifugação a 3.500 xg, 4 ° C durante 15 minutos numa centrífuga de bancada. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos de centrífuga refrigerada. Centrifugar a 14.000 xg, 4 ° C durante 30 minutos numa centrífuga para remover mitocôndrias. </li><li> Transferir o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação refrigerados. Centrifugar a 200.000 xg, 4 ° C durante 90 minutos em uma ultracentrífuga para recolher microssomas. </li><li> Decantar cuidadosamente e descartar o sobrenadante e adicionar 2 ml de tampão de gelo CFTR frio com inibidores da protease e DTT 1 mM a cada tubo. Volte a suspender suavemente as bolinhas usando um pincel, topo-se cada tubo com tampão CFTR e misture usando um misturador de vórtice. </li><li> Centrifugar a suspensão a 200.000 xg, 4 ° C durante 60 minutos em uma ultracentrífuga, descartar os peletes sobrenadante e ressuspender em 2 ml de tampão arrefecido em gelo CFTR with inibidores de protease (Sem DTT), utilizando um pincel. </li><li> Reúnem-se os microsomas ressuspensão, ajustar o volume final para 50 ml com tampão de CFTR e misturar bem. Reserva uma alíquota de 1 ml para análise SDS-PAGE em gel, como descrito no 2,9-2,11. Os microssomas pode agora ser flash congelados em azoto líquido e, em seguida, armazenada a -80 ° C até serem necessários. </li><li> CFTR pode ser extraído a partir de microssomas usando um dos seguintes: detergentes lítio perfluorooctonoate ácido (LiPFO), tetradecanoly-liso fosfatidilglicerol-(LPG14), n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM). Misturar os microssomas com tampão CFTR, os inibidores da protease e 5% de detergente (w / w). Se DDM é usado, também adicionar NaCl 300 mM para o buffer. Agitar a 4 ° C durante 15 minutos num rotor tubo. </li><li> Centrifugar as amostras a 100.000 xg, 4 ° C durante 1 hora em uma ultracentrífuga. Reter o sobrenadante e tomar uma pequena alíquota para SDS-PAGE análise em gel. CFTR pode agora ser purificado a partir do material solublised por metal imobilizadocromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. </li></ol> 4. Os resultados representativos Transformação de levedura com o plasmídeo contendo CFTR não é 100% eficiente. Uma tela de pequena escala representativa de expressão de CFTR em colónias seleccionadas a partir de uma experiência de transformação irá produzir cerca de 1 em 4 colónias que expressam a proteína. Um resultado típico de uma tela de 5 colónias separado a partir de uma placa é mostrado no painel A da fig. 3. Uma das colónias mostra uma forte nível de expressão da proteína de fusão CFTR-GFP que funciona tipicamente entre os 250 kDa e 130 kDa marcadores, como mostrado. Os níveis de CFTR-GFP fluorescência irá variar consideravelmente entre experiências, com colónia na Fig. 4. 3 mostrando pelo menos fluorescência 10x maior do que a banda intrínseca de fluorescência a cerca de 70kDa. Se os níveis de expressão de CFTR-GFP parecem dar menos de fluorescência do que a banda de 70 kDa, então é provavelmente valor re-transformando e escolhendo uma colóniacom níveis mais elevados de CFTR-GFP expressão. Como mostrado na fig. 3A, é improvável, mesmo com um nível de expressão elevado de CFTR-GFP, que a banda CFTR-GFP será visível no extracto celular por coloração com Coomassie. Uma vez que as colónias seleccionadas foram cultivadas em experiências de maior escala, e microssomal isolado, a presença de CFTR-GFP dentro dos microssomas terá de ser avaliada, como mostrado na fig. 3B. Os resultados desta experiência são importantes, não só para avaliar a eficiência da indução da expressão, mas também para verificar que os microssomas foram preparados cuidadosamente e que a proteólise foi minimizada. Os resultados mostrados na Fig. 3B implica que nesta experiência a expressão de CFTR GFP-é um pouco menor (como julgado em relação à banda intrínseca 70kDa) do que na experiência em pequena escala mostrada no painel A. No entanto esta impressão é influenciado pela exposição excessiva do detector de fluorescência na presente medição. Isto porque o experimentador era Checking para a presença de fragmentos proteolíticos do CFTR construir. Existe alguma evidência nesta experiência para alguns fragmentos proteolíticos fluorescentes entre os 130 kDa e 100 kDa marcadores, mas estes são muito fraca em comparação com a banda de comprimento completo CFTR GFP. Com os inibidores da protease aqui descrito, encontramos pouca evidência para a degradação proteolítica da CFTR após ruptura das células. Se proteólise significativa é observada, recomendamos fazer novas soluções de protease inibidores. Descobrimos também que comerciais de protease comprimidos de cocktail de inibidores não são tão eficazes para este sistema. Crescimento de células para além de 16 horas (pós-indução) irá dar origem a expressão de CFTR diminuiu como mostrado na Figura 4. Isto é provavelmente devido ao volume de negócios da proteína, talvez devido à regulação positiva da levedura mecanismos de controlo da qualidade protéica 6-9,13. Por isso, é aconselhável monitorizar os níveis de expressão do gene CFTR após a indução com galactose, se possível, como o tempo ideal para a colheita das células may variam de um laboratório para outro. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig1.jpg" /> Figura 1. O construto CFTR levedura contendo o plasmídeo. A fusão CFTR-GFP-8His é inserido no vector de expressão 2μ p424GAL1, sob o controlo de um promotor de galactose (GAL1). O vector também contém um marcador de selecção de uracilo (URA) e um gene de resistência à ampicilina (Amp). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig2.jpg" /> Figura 2. Um fluxograma que resume o protocolo visualizadas. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig3.jpg" /> Figura 3. Representativos géis de SDS-PAGE de expressão de CFTR e purificação. O painel A mostra cinco colónias transformantes escolhido aleatoriamente (pistas 1-5), que foram rastreadas para a expressão de CFTR. O painel B mostra microssomas que foram isoladas a partir de um FERM 15Lentrar cultura. O painel C mostra purificado CFTR murino obtido após duas fases de purificação utilizando cromatografia de afinidade, seguido por cromatografia de exclusão de tamanho. Todos os géis são mostradas sob condições de iluminação fluorescente emocionante a partir do domínio GFP (esquerda) e depois Coomassie manchar (direita). As posições relativas dos padrões de peso molecular estão listados no lado esquerdo (kDa). <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3860/3860fig4.jpg" /> Figura 4. Os dados representativos para a expressão de CFTR em levedura. O painel A mostra um tempo-curso de expressão de CFTR após indução com galactose. Os extractos celulares foram analisados ​​por SDS-PAGE, ea fluorescência da GFP para a banda de proteína CFTR-GFP foi integrado. B Painel mostra os resultados típicos para microscopia de fluorescência de GFP células que expressam 16 após a indução hr. Tipicamente, apenas uma fracção das células expressar CFTR em níveis elevados.

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	<li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+three-dimensional+structure.">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li><li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling.">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li><li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li><li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast.">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li><li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation.">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li><li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+complexes+(ERACs)+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+are+degraded+by+autophagy.">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li><li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+CFTR+folding+mutants.">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li><li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast.">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li><li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li><li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+wood+through+the+trees:+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence.">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li><li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit.">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li><li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li><li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway.">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding.">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li><li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li><li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li><li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysophosphatidylglycerol:+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este documento apresenta um método para a expressão da proteína CFTR murino em células de levedura, que deve facilitar a pesquisa sobre a fibrose cística. O objetivo é vincular esse papel com o lançamento do murino CFTR DNA construção, que estará disponível através da Cystic Fibrosis Foundation ( <a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a> ). Ortólogos outro deve ficar disponível mais tarde. Transformação das células de levedura com o vector contendo CFTR é simples, mas é importante para o rastreio de colónias que expressam níveis elevados de CFTR. Os níveis de expressão variável pode surgir a partir de vários factores, mas o número de cópias do plasmídeo por célula provavelmente representa um grau significativo de variação. As etapas críticas descritas aqui devem permitir a produção de CFTR expressam células de levedura e CFTR contendo membranas microssomais. Uma vez que a transformação, o crescimento da colheita, e lise de células de levedura foram dominados, Purificação da proteína deve ser possível, e na Figura 3, deram um exemplo da pureza que deve ser exequível, neste caso, como valor de referência útil. Não é nossa intenção neste manuscrito para fornecer metodologia detalhada para a purificação da proteína. No entanto, há algumas críticas passos de purificação a jusante que são específicos para o sistema de expressão S.cerevisae, tais como a lise das células e purificação microssoma, e estes foram incluídos em detalhe neste manuscrito. Deve ser mencionado, contudo, que para além dos dois métodos já foram utilizados, alternativas de levedura métodos rompimento celular podem ser empregues, tais como a utilização de uma célula de pressão francesa. A proteína recombinante tem um TEV-clivável domínio GFP C-terminal que permite que a proteína a ser rastreado após a indução (Fig. 4). A levedura tem uma proteína intrínseca 70kDa (provavelmente succinato desidrogenase 12), que fluoresce sob as mesmas condições de 11, e este pode proporcionar um entre útilpadrão de calibração nal para os níveis de expressão relativa da CFTR em extractos de células inteiras ou microssomas (Fig. 3). É evidente a partir dos dados mostrados na Figura 4 que o momento da colheita de células após a indução com galactose é crucial. As produções de gota CFTR precipitadamente após cerca de 16 h de indução, de modo que não há quase qualquer CFTR detectável em células de levedura após 24 h de indução. O rendimento de proteína purificada é de cerca de 1-2mg proteína CFTR por 15 cultura fermentador litro. A recuperação pode ser estimada como cerca de 70% da proteína CFTR GFP-total até ao estádio de microssoma, e recuperação de cerca de 25% da proteína purificada. Caracterização da S. cerevisiae, expressa CFTR está em curso. Como visto na fig. 4, a localização da proteína na célula pode ser monitorizada por microscopia de fluorescência. Embora muito da fluorescência é encontrada ao redor da periferia da célula como 10 esperado, alguma da proteína exibe uma localização ponteada, quer em, ouapenas no interior da membrana plasmática, que pode ser devido a CFTR reciclagem através de uma via de Golgi / endossomal tardia 14 ou talvez a jusante compartimento da floração de vesículas de transporte do ER 4. O tratamento com PNGaseF, uma enzima que deglycosylates proteínas, mostraram alteração mínima da migração da banda de proteína CFTR em SDS-PAGE, o que implica que é não glicosilada, ou tem de glicosilação mínimo 15. Experiências sobre o estado de fosforilação da proteína estão em curso. Em alguns dos detergentes testados até à data, a proteína purificada exibe actividade ATPase (que é inibida por um inibidor específico CFTR 16) a taxas que são semelhantes aos anteriormente publicado 2,15. Medição da actividade do canal CFTR exigirá a reconstituição da proteína purificada, o que implicaria um passo de purificação final em um detergente que tem uma relativamente elevada concentração micelar crítica (CMC) 17. Levedura microssomas containing CFTR pode ser solublised com vários detergentes vulgarmente utilizados 18, incluindo detergentes tais como dodecil maltosídeo 2, os quais são geralmente considerados &#39;suave&#39;. No entanto mais elevados detergentes cmc provaram ser ineficientes para solubilsation, até agora, o que sugere que em troca estes detergentes devem ser considerados numa fase tardia em qualquer esquema de purificação.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> No Catálogo </td></tr><tr><td> FGY217 estirpe S. cerevisiae, com supressão pep4 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base de levedura de nitrogênio sem aminoácidos </td><td> Formedium </td><td> CYN0410 </td></tr><tr><td> Conclua mistura suplemento sem uracil </td><td> Formedium </td><td> DCS0169 </td></tr><tr><td> Ágar bacteriológico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5306 </td></tr><tr><td> D-galactose </td><td> Pescador </td><td> BP656-500 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Pescador </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> Pepstatina A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Merck </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> Quimostatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7268 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td></tr><tr><td> Epoxysuccinyl leucylamido-butano-(E-64) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E3132 </td></tr><tr><td> Fluoreto Aminoethylbenzenesulfonyl (AEBSF) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8456 </td></tr><tr><td> Cloridrato de benzamidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 434760 </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> ditiotreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td></tr><tr><td> ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Pescador </td><td> BP120500 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> Formedium </td><td> TRIS01 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Pescador </td><td> P631 </td></tr&gt; <tr><td> D-sorbitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1876 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> 065017 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> N-dodecil-β-D-maltopyranoside </td><td> Affymetrix </td><td> D310S </td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 114391 </td></tr><tr><td> Além disso PageRuler padrões proteicos prestained </td><td> Fermentas </td><td> SM1811 </td></tr><tr><td> NuSep tris-Gly 4-20% géis de gradiente </td><td> NuSep </td><td> NB10-420 </td></tr><tr><td> Instantânea azul Coomassie Mancha </td><td> Novexin </td><td> ISB1L </td></tr><tr><td> Contas de vidro, lavado com ácido </td><td> Sigma </td><td> G8772 </td></tr><tr><td> 50ml estéreis Tubos Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 </td></tr><tr><td> 2mlEstéreis tampa de rosca frascos </td><td> Sarstedt </td><td> 72.694.005 </td></tr><tr><td> 250ml Erlenmeyer estéril perplexos </td><td> BD Biosciences </td><td> 355119 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer estéril 2l perplexo frascos </td><td> BD Biosciences </td><td> 355131 </td></tr><tr><td> 2ml tubos de microcentrífuga </td><td> Sarstedt </td><td> 72,695 </td></tr><tr><td> 0.2μM filtro de seringa </td><td> Músculo da coxa </td><td> FC121 </td></tr><tr><td> tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 355618 </td></tr><tr><td> tubos de centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 357000 </td></tr><tr><td> 1l potes de centrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 969329 </td></tr><tr><td> Orbital agitação incubadora com controlo de temperatura </td><td> New Brunswick Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Deltavision RT microscópio restauração </td><td> Aplicada Visão </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de bancada </td><td> Hermle </td><td> Z300 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga de bancada </td><td> Pescador </td><td> 13-100-511 </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Estrela Labs </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon Scanner Trio </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-87 </td></tr><tr><td> LAS3000 sistema de imagem </td><td> Fuji </td><td></td></tr><tr><td> Navio fermentador 20l e unidade de controle </td><td> Applikon </td><td></td></tr><tr><td> Desregulador constante de célula sistemas </td><td> Sistemas constantes </td><td></td></tr><tr><td> Beadbeater disruptor celular </td><td> BioSpec </td><td> 1107900 </td></tr><tr><td> Mini-beadbeater-16 </td><td> BioSpec </td><td> 607 </td></tr><tr><td> JA-17 rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369691 </td></tr><tr><td> Optima L-100 ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 392050 </td></tr><tr><td> Rotor 50.2Ti </td><td> Beckman Coulter </td><td> <a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901" target="_blank">337901</a> </td></tr></tbody></table>

expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in saccharomyces cerevisiae

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR) é um canal de cloreto de que, quando mutado, pode dar origem a fibrose cística em humans.There é, portanto, um interesse considerável na presente proteína, mas os esforços para estudar a sua estrutura e actividade tem sido dificultada pela dificuldade de expressar e purificação de quantidades suficientes de proteína de 1-3. Tal como muitos &#39;difíceis&#39; proteínas de membrana eucarióticas, a expressão num organismo de crescimento rápido é desejável, mas desafio, e na levedura S. cerevisiae, até agora baixas quantidades foram obtidos e rápida degradação da proteína recombinante foi observada 4-9. Proteínas envolvidas no processamento de CFTR recombinante em levedura foram descritos 6-9. Neste relatório nós descrevemos um método para a expressão de CFTR em levedura e sua purificação em quantidades significativas. O protocolo descreve como os problemas de proteólise anteriores podem ser ultrapassados ​​e os níveis de expressão de comoCFTR pode ser muito melhorada pela modificação das condições de crescimento de células e controlando as condições de indução, em particular o período de tempo antes de a colheita das células. Os reagants associados com este protocolo (CFTR murina expressando células de levedura ou plasmídeos de levedura) serão distribuídos através da Cystic Fibrosis Foundation EUA, que patrocinou a pesquisa. Um artigo descrevendo o projeto e síntese da CFTR construto utilizado neste relatório será publicado separadamente (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). Neste artigo, vamos explicar o nosso método de início com a transformação das células de levedura com a construção de CFTR - levedura contendo plasmídeo (Fig. 1). A construção tem uma sequência de proteína verde fluorescente (GFP) fundido com CFTR no seu terminal C e segue o sistema desenvolvido por Drew et al. (2008) 10. O GFP permite a expressão e purificação de CFTR a ser seguido de forma relativamente fácil. O protocolo JOVE visualizadosacabamentos ol após a preparação de microssomas a partir das células de levedura, embora incluem algumas sugestões para a purificação da proteína a partir dos microssomas. Os leitores pode desejar adicionar suas próprias modificações ao processo de purificação microssoma, dependente das experiências finais a serem realizadas com a proteína e do equipamento local disponível para eles. A levedura-expressa a proteína CFTR pode ser parcialmente purificada utilizando cromatografia de afinidade de iões metálicos, usando uma marca de purificação intrínseca poli-histidina. Cromatografia de exclusão de tamanho subsequente produz uma proteína que parece ser&gt; 90% pura, conforme avaliado por SDS-PAGE e coloração com Coomassie do gel.

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Têm, até agora, produziu quantidades relativamente baixas de proteína. Este protocolo e os reagentes associados distribuídos através da Fundação de Fibrose Cística deve permitir a preparação de quantidades de miligramas desse &quot;difícil&quot; proteína de membrana eucariótica.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

18.4K visualizações.  University of Manchester. Tentativas para expressam a fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR) em Saccharomyces cerevisiae Têm, até agora, produziu quantidades relativamente baixas de proteína. Este protocolo e os reagentes associados distribuídos através da Fundação de Fibrose Cística deve permitir a preparação de quantidades de miligramas desse "difícil" proteína de membrana eucariótica.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Monitorado Redox Titulação de cofatores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...