Gostaríamos de agradecer a Katharina Cosker e Stephanie Courchesne para discussões úteis.

Preparação de reagentes <ol><li> Revestimento de colágeno: colágeno casaco p35 placas de cultura de tecidos e coloque em um forno a 37 ° C por 2 dias antes da lubrificação os divisores. A concentração final de colágeno deve ser a 0,71 mg / ml diluída em HCl 0,001 N. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura por placa. </li><li> Carregadores de graxa: A fim de preencher o carregador de graxa, uma seringa de 60mL primeiro deve ser preenchido com Corning graxa de vácuo. Use a seringa para encher o carregador de graxa, envolvê-la em papel alumínio e depois autoclave por 45 minutos. </li><li> Teflon divisores: os divisores podem ser reutilizados depois de cada experiência, mas deve primeiro ser devidamente limpos. Remover o divisor da placa, limpe toda a graxa restante e coloque em ácido sulfúrico por 2 dias. Após a remoção do ácido, lavar com água ferver, 3X por 20 minutos, deixar secar, coloque em um prato de vidro petri p100 e autoclave por 20 minutos. </li><li> N2-metilcelulose: Pesar 1,5 g de metilcelulose e colocá-lo em uma garrafa de 500ml. Adicionar uma barra de agitação e autoclave por 20 minutos a seca (a partir deste ponto todo o trabalho deve ser estéril). Em seguida, adicione 500 ml de soro de mídia livre (N 2), e mexa em uma sala fria até que se dissolva. Alíquota em 50 conicals mL e congelar a -20 ° C. Para trabalhar ações alíquota, uma das 50 conicals mL em tubos de 1 ml e congelar a -20 ° C. </li><li> DRG mídia: DMEM, 5% soro de cavalo calor inativada, e 1% de estreptomicina penicilina. </li><li> 100ng/mL DRGN mídia: A concentração de ações de ambas fator de crescimento neural (NGF) e cérebro fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é 1mg/mL. Diluir cada uma das neurotrofinas 1:10.000 na mídia DRG. Culturas podem ser cultivadas em NGF sozinho, isso altera o complemento de neurônios que sobrevivem nas culturas. Nota: Quando necessário, a concentração de (citosina arabinosídeo) ARAC é 1um e usado em uma concentração final de 0.3uM. Isso vai inibir o crescimento de células de Schwann e células gliais outros. </li><li> 10ng/ml DRGN mídia: Diluir o 100ng/mL DRGN media (1:10) com a mídia DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="392" height="294" /> Figura 1. Ferramentas necessárias para set-up </li></ol> Criação de câmaras compartimentada (iniciar este processo de 1-2 dias antes da dissecção) <ol><li> Faça um arranhão no meio de um prato de colágeno p35 revestido com um movimento para fora. </li><li> 30ul lugar de metilcelulose N2-on no meio do zero. Conjunto de pratos de lado até divisor é lubrificada. </li><li> Anexar um adaptador de 23-gauge esboço luer para o carregador de graxa. Divisor de aderência do Teflon com um par de 90 ° hemostats ângulo e coloque-o deitado, com o divisor para cima sob um microscópio. Traçar o divisor com graxa certificando-se que cada vez que o adaptador é colocado em um novo ponto de partida o adaptador é inserido na graxa da etapa anterior para que haja uma linha contínua de graxa (ver diagrama). Uma vez que a graxa é aplicada ao divisor inteiro, por sua vez um dos pratos preparados p35 de cabeça para baixo e colocá-lo de modo que o N2 metilcelulose é sobre o compartimento do meio. Pressione para baixo no fundo do prato com um par de pinças. Certifique-se de imprensa no interior do divisor em quatro cantos (superior esquerdo, inferior direito, superior direito, inferior esquerdo, indicado no diagrama por &quot;X&quot;). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figura 2" width="171" height="183" /> Figura 2: Passos para lubrificar o divisor Nota: É importante pressionar firmemente o suficiente para que a graxa faz uma vedação completa com o prato, mas se muita pressão é adicionado, os axônios não vai cruzar os compartimentos laterais. Pegue o hemostats, vire-o e unclamp o divisor. Por último, coloque o prato com o divisor firmemente presa sob o microscópio com foco na parte inferior do compartimento do meio. Com o carregador de graxa, fazer uma pequena barreira (0,25 centímetros), de modo que uma vez que as células são colocadas no compartimento central não podem vazar. </li><li> Depois de ter criado várias culturas, a mídia local DRG em cada um dos compartimentos laterais e coloque em uma incubadora na qual as células serão mantidas. Permitir que as culturas para sentar-se por várias horas e depois verificar se há vazamento. Se a mídia vazou dentro do compartimento do meio, então a cultura é inutilizável. Nota: Ao primeiro aprender esta técnica, é importante a criação de culturas mais do que o necessário para uma experiência, como várias será furado. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figura 3" width="254" height="191" /> Figura 3: &quot;Boa vs leaky&quot; cultura </li></ol> Manutenção de neurônios DRG em culturas compartmented <ol><li> Dia 1: Substituir DRG media nos compartimentos laterais com 100ng/mL DRGN media + ARAC. Realizar dissecção e adicionar células para o compartimento central (100 mil células). </li><li> Dia 2: Adicionar 10ng/ml media + ARAC para o exterior do divisor de Teflon até que a mídia flui sobre a barreira de graxa e fluido intercâmbio com o compartimento central. </li><li> Dia 3: Substitua media nos compartimentos laterais para 100ng/mL DRGN omitindo a ARAC eo surround com 10ng/ml DRGN omitindo a ARAC. </li><li> Dia 6: Substitua media nos compartimentos laterais para 1ng/mL + ARAC eo surround com DRG media + ARAC. </li><li> Dia 9: Use para a experimentação. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figura 4" width="267" height="148" /> Figura 4: imagens IHC de corpos celulares e axônios distais Nota: Ao mudar a mídia, é importante para aspirar o líquido da parte superior do compartimento de cada lado. Além disso, nunca alterar a mídia a partir do compartimento central em si, apenas a partir do surround, e deixe fluir por cima da barreira de graxa no centro. </li></ol>

<ol>
	<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites.">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response.">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li><li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons.">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li><li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures.">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos como se preparar e manter câmaras compartimentado para uso em neurônios DRG cultura. Feito corretamente, este sistema permite a separação do corpo celular do axônio para estudar mecanismos pelos quais neurotrofinas sinal através axônios longos. Uma vez que não é o isolamento fluídico entre os compartimentos, que permite a estimulação seletiva ou tratamento de um compartimento sem a outros compartimentos sendo afetados. Culturas câmara compartimentada pode suportar outros tipos de células, incluindo n...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>collagen</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354249</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2-methylcellulose 400CPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sel-Win Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon divider</td>
<td>Other</td>
<td>Tyler Research</td>
<td>CAMP10</td>
<td>many other types of dividers are available</td>
</tr>
<tr>
<td>Pin rake</td>
<td>Tool</td>
<td>Tyler Research</td>
<td>Camp-PR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grease loader</td>
<td>Tool</td>
<td>Tyler Research</td>
<td>Camp-GLSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>MT10017CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Peprotech</td>
<td>450-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BDNF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Peprotech</td>
<td>450-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-635-5D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AraC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>23 gauge luer stub adapter</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>427565</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>90&deg; angle hemostats</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-7035</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and maintenance of dorsal root ganglia neurons in compartmented cultures

Neurônios estender os processos axonal que estão longe do corpo celular para inervar tecidos-alvo, onde alvo derivado fatores de crescimento são necessários para a sobrevivência neuronal e na função. Neurotrofinas são especificamente necessárias para manter a sobrevivência e diferenciação de neurônios sensoriais que inervam mas a questão de como esses neurotrofinas-alvo derivado comunicar para o corpo celular dos neurônios que inervam tem sido uma área de pesquisa ativa por mais de 30 anos. O modelo mais comumente aceita de como sinais de neurotrofina chegar ao corpo celular propõe que a sinalização endossomos transportar este sinal retrogradamente ao longo do axônio. A fim de estudar o transporte retrógrado, um sistema de cultura foi originalmente concebido por Robert Campenot, em que os corpos celulares estão isolados de seus axônios. A técnica de preparação destas câmaras compartimentado para recapitula cultura sensorial neurônios a estimulação seletiva dos terminais dos neurônios que ocorre na liberação in vivo de seguir-alvo derivado neurotrofinas. Retrógrada eventos que requerem sinalização de longo alcance microtúbulos transporte retrógrado dependentes têm implicações importantes para o tratamento de doenças neurodegenerativas.

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Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K visualizações.  Dana Farber Cancer Institute. Aqui, descrevemos a técnica de preparação e manutenção de câmaras compartimentada para os neurônios sensoriais cultura do gânglio da raiz dorsal.