Este trabalho foi suportado por concessões aos FZ do NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.

1. Preparação de Lamelas, meio de cultura, e as enzimas da digestão <ol><li> A rodada de 12 mm # 1 lamelas de vidro são usados ​​para a cultura neuronal. As lamelas são limpos com 10% de HCL durante a noite seguido por lavagem de ultra-sons com água destilada e desionizada por 3 vezes (20 minutos / hora). As lamelas limpos são armazenados em etanol a 70% para uso futuro. Antes de cada experimento, as lamelas são secos ao ar e colocado na placa de cultura. </li><li> Para revestir as lamelas secos, 100 ul de solução de revestimento contendo 100 ug / ml de poli-D-lisina e 10 ug / ml de solução de laminina de trabalho é adicionado em cada lamela e da placa de cultura é transferida para uma incubadora a 37 ° C. Após 1-2 horas, a solução de revestimento é removida e as lamelas são lavadas 3 vezes com PBS estéril 1X. </li><li> Para preparar o meio de cultura, o meio essencial mínimo (MEM) é suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), 1X solução Penicilina-Estreptomicina (500 unidades de penicilinaLin e 500 ug de estreptomicina), 1X suplemento Glutamax-I, e os reagentes antimitóticos contendo 20 uM 5-fluoro-2-desoxiuridina e 20 uM uridina (FDU / R). Para o meio isento de soro, a FBS é substituído com o suplemento de B27. </li><li> A colagenase-se uma solução preparada por dissolução de um pó com colagenase MEM para fazer uma concentração de trabalho de 1 mg / ml. Para a tripsina, a 1X TrypLE expresso é usado. </li></ol> 2. Dissecção e Colheita de neurônios de camundongos adultos DRG <ol><li> Após a eutanásia a 6 - para rato adulto de 10 semanas de idade, retire a pele dorsal e cortou toda a coluna vertebral. Lavar a coluna vertebral removido com 1 x PBS 2-3 vezes. </li><li> Pino da coluna vertebral removido para a placa de dissecação com até lado ventral, e remove cuidadosamente músculos para expor os nervos sensoriais sob um microscópio de dissecação. Os nervos conectados ao DRGs a nível madeira são mais grosso e fácil de localizar. Por conseguinte, apenas para a maioria das experiências, a lombarDRGs são colhidos. </li><li> Corte através de cada vértebra ao longo da linha central com uma tesoura pequena e remova cuidadosamente os discos intervertebrais. Utilizando uma pinça para dividir cada vértebra para expor a medula espinhal. </li><li> Para dissecar os DRGs madeira, levante cada nervo madeira com uma pinça e traçar em direção à medula espinhal para localizar os DRGs associados lombares (L1 a L6). </li><li> Corte cada DRG de nervo periférico em anexo, as raízes dorsal e ventral com uma tesoura de primavera, e armazená-lo em tubo de microcentrífuga com meio MEM colocada em gelo. DRGs Mais em diferentes níveis da coluna vertebral torácica (por exemplo, DRGs) pode ser dissecados para fora de uma forma semelhante, quando necessário. </li></ol> 3. Digestão e Dissociação de neurônios de camundongos adultos DRG <ol><li> Depois de recolher todos os DRGs dissecados, substituir o meio MEM com 1 ml de colagenase Uma solução e incubar o tubo de microcentrífuga a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Substituir solução de colagenase A com 500 uL 1X TrypLE expresso de modolução e incubar a 37 ° C durante 15-20 min. </li><li> Remover a solução expresso TrypLE e lavar os DRGs com um meio de cultura ml preparada (contendo 5% de FBS) por 3 vezes. </li><li> Adicionar 600 uL meio de cultura e suavemente pipetar cima e para baixo para triturar os tecidos durante 20-30 vezes utilizando um 1 ml azul, pipeta graduada ponta. </li><li> Após trituração, permitir que os tecidos não-dissociados para se estabelecer a parte inferior da microcentrífuga e transferir a suspensão de células para um tubo de 10 ml estéril. Adicionar outro meio de cultura 600 ul e repita o passo trituração até a maioria dos tecidos são dissociados. A suspensão de células obtida contém ambos os neurónios e células não neuronais. Na maioria dos casos, as células dos 6 DRGs (~ 5 x10 4) são utilizados para uma reacção electroporação. </li></ol> 4. Manipulação genética de neurônios por meio de Eletroporação <ol><li> Preparar a solução de transfecção por mistura da solução nucleofection Amaxa para os neurónios do rato com os plasmídeos de ADN (~ 10 ug) Ou oligos siRNA (~ 0,2 nmol) para fazer um volume final de 100 uL de cada transfecção. </li><li> Centrifugar as células dissociadas a 680 rpm durante 7 minutos à temperatura ambiente, e elimine o sobrenadante, tanto quanto possível. Adicione a solução de transfecção preparado e delicadamente pipetar cima e para baixo 3-4 vezes com 200 dicas Pipetar para re-suspender as células. </li><li> Transferir a suspensão de células misturada com a solução de transfecção para a cuvete de electroporação e electroporate as células usando o programa de sistema Amaxa Nucleofector G-013. </li><li> Após a electroporação, imediatamente adicionar 500 uL de pré-aquecida (37 ° C) meio de cultura contendo FBS a cuvete e transferir toda a solução de (~ 600 ul) para a placa de cultura revestidas com densidades celulares desejadas. Para os experimentos de que requer re-suspensão e re-plaqueamento, os neurónios são cultivadas directamente sobre o prato de cultura de plástico em alta densidade (10000-20000 células / poço). Para experimento que examina diretamente o crescimento do axônio, os neurônios são banhados ontó lamelas de vidro revestidas com menor densidade (3000-5000 células / poço). Colocar a placa de cultura para a incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Quatro horas após plaqueamento quando os neurónios foram ligados aos substratos, suavemente substituir o meio de cultura (que contém a solução nucleofection Amaxa) com 500 uL meio de cultura fresco e pré-aquecido, e voltar a placa para a incubadora para a cultura adicional (37 ° C , 5% de CO 2). Tanto o meio de cultura contendo FBS ou o meio isento de soro pode ser utilizada neste passo. </li></ol> 5. Cultura Adulto neurônios DRG para Análise de crescimento do axônio <ol><li> Para os neurónios transfectadas com plasmídeos de ADN, a expressão do gene de interesse (por exemplo, EGFP) pode ser observado tão cedo quanto uma hora após poucos electroporação. Para os neurónios transfectadas com siRNAs, normalmente esperar 3-4 dias para permitir que a depleção suficiente das proteínas endógenas. Os neurônios em cultura pode ser diretamente fixado para axônio análise de crescimento em varionos pontos de tempo (1-4 dias após a electroporação) ou re-suspensa e re-plaqueadas para analisar axónio recrescimento (ver abaixo). </li><li> Para RNAi mediadas de perda de função-estudos, os neurónios em cultura pode ser re-suspensa e re-plaqueadas para permitir axónios para regenerar a partir de neurónios, em que as proteínas alvo são já esgotadas. Para fazer isso, substituir o meio de cultura de idade dos neurónios de alta densidade cultivadas com 1 ml de meio pré-aquecido fresco e pipeta suavemente para cima e para baixo para 6-10 vezes para re-suspender os neurónios em anexo da placa de cultura. Devido células não neuronais (eg células de Schwann) anexar muito mais apertado para o prato de cultura de neurónios, as células ressuspensas são principalmente os neurónios. </li><li> Transfira os neurónios re-suspenso em um tubo de microcentrífuga e suavemente triturar 10-15 vezes para re-dissociar os aglomerados de células na suspensão de célula única. </li><li> Re-plate os neurónios re-dissociados em lamelas recém-preparados a baixa densidade (3000-5000 células / poço) e cultura durante a noite (16-24 horas). </li></ol> 6. Fixação, coloração imuno-fluorescência e imagem <ol><li> Aspirar o meio e adicionar paraformaldeído a 4% (PFA) (200 ul / poço) para fixar as células para 15-20 min à temperatura ambiente. As células fixas são então lavadas com PBS 1X por 3 vezes. </li><li> Aspirar o PBS e adicionar a solução de bloqueio (1% de albumina de soro bovino, 0,1% Triton X-100, e soro de cabra normal de 2,0% em PBS 1X) para os neurónios fixos para 60 min à temperatura ambiente. </li><li> Para os axônios de etiquetas, os neurônios são imuno-coradas com anti-neurofilamentos ou anticorpos anti-βIII tubulina. Para fazer isso, colocar uma gota 30μl de solução de anticorpo primário (diluição 1:1200 para a-tubulina βIII anticorpo) em um parafilme para cada lamela. Inverta as lamelas e colocá-los para a solução de anticorpo primário durante 60 min à temperatura ambiente. </li><li> Retornar lamelas à placa de cultura original e lavá-las com PBS 1X por 3 vezes. </li><li> Repita o mesmo procedimento para o secundário umatibody. </li><li> Lave as lamelas com água destilada por 3 vezes, e depois montar as lamínulas em lâminas de vidro com a solução de montagem (por exemplo, prolongar Antifade Gold). </li><li> Os neurônios corados podem ser visualizados com qualquer sistema de microscopia de fluorescência equipado com uma câmera digital. Os comprimentos dos axônios são medidos e analisados ​​com software de imagem análise. </li></ol> 7. Os resultados representativos Na ausência de qualquer adição de factores de crescimento extracelulares, os neurónios DRG adultos geralmente começam a crescer axônios 48 hr após o plaqueamento em primeiro lugar. Os axónios mostram frequentemente morfologias ramificado (Figura 1). Em contraste, os neurónios re banhados começar a estender axónios apenas uns poucos hr após o plaqueamento, e os axónios alongado com ramificação muito reduzida (Figura 2). Estes resultados sugerem que re banhados neurónios partilham propriedades semelhantes às de neurónios lesionados condicionado. Usando essa abordagem, recentemente realizado perda dede função de estudos para examinar o papel do fator de transcrição regeneração do axônio associado c-Jun em crescimento do axônio de adultos neurônios DRG in vitro. Os resultados mostraram que a electroporação de um grupo de 4 siRNAs diferentes de segmentação regiões diferentes de c-Jun (ON-TARGETplus) marcadamente reduzida nos níveis de proteína de c-Jun em neurónios DRG adultos 3 dias após a transfecção (Figura 3) 9. Quando os neurónios foram re-plaqueadas e cultivadas de crescimento, durante a noite axónio de neurónios de c-Jun knockdown foi significativamente reduzida (Controlo: 348,37 ± 16,21 milímetros; SI-c-Jun: 262,32 ± 15,69 uM, a Figura 3) 9. Estes resultados indicam que os neurónios DRG cultivadas adultos proporcionar um sistema modelo útil para estudar o crescimento axonal a partir de neurónios de adultos. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Figura 1. Adulto neurónios DRG de rato cultivadas a baixa densidade durante 3 dias. Os neurônios corados com anti - &amp; beta; III anticorpo tubulina. Note-se que a maioria dos axônios mostram morfologias ramificadas. Barra de escala: 125 mM. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Figura 2. Re-plating rato adulto DRG neurónios após 3 dias em cultura. (A) neurónios DRG Adulto cultivados a alta densidade, durante 3 dias. (B) Re banhados neurônios DRG adultos foram cultivados em baixa densidade para pernoite. Observe que a maioria dos axônios mostram morfologias alongadas com pouca ramificação do axônio. Barra de escala: 250 um em A e 125 M em B. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Figura 3. Papel de c-Jun em axónio crescimento de neurónios DRG adultos in vitro. (A) análise de Western blot de c-Jun em rato adulto DRG neurônios após a eletroporação de siRNAs c-Jun. O resultado mostra o nível marcadamente reduzida de c-Jun. (B) Controle de neurônios transfectadas com EGFP cresceu axônios longos após a re-regulamentação e da cultura durante a noite. (C) Co-transinfecção de c-Jun siRNAs e crescimento do axônio EGFP prejudicada de adultos neurônios DRG após a re-regulamentação e da cultura durante a noite. Vermelho: coloração Tuj-1; Verde: EGFP. Barra de escala: 125 mM. Estes resultados foram publicados em Saijilafu et al. 9.

<ol>
	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neurónios DRG adultos regenerar os seus axónios robustamente após a lesão do nervo periférico in vivo e in vitro, proporcionando assim um sistema útil para estudar a regeneração axonal em animais adultos. In vitro cultura de neurónios DRG adultos se está a tornar um método largamente utilizado para investigar os mecanismos moleculares pelos quais axônio regeneração é regulada. O procedimento in vitro de neurônios adultos cultura do mouse DRG aqui apresentada p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poli-D-Lisina bromidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> A laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-desoxiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE expresso </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Vidro lamelas (# 1) </td><td> Microscopia eletrônica de ciências </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 placa de cultura de células bem </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Água destilada estéril e desionizada </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Nucleofector e eletroporação Kits para os neurônios de rato </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus siRNA contra c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043.776 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti - tubulina βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> Prolongar a solução de Ouro Antifade montagem </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

É bem conhecido que os neurónios maduros no sistema nervoso central (CNS) não pode regenerar os seus axónios após lesões devido a capacidade intrínseca diminuída para suportar o crescimento axonal e um ambiente hostil no CNS 1,2 madura. Em contraste, os neurónios maduros no sistema nervoso periférico (PNS) regenerar rapidamente após lesões 3. Adultos gânglio da raiz dorsal (DRG) neurónios são bem conhecidos para regenerar vigorosamente após lesões dos nervos periféricos. Cada neurônio DRG cresce um axônio da célula soma, que se divide em dois ramos: um ramo do axônio periférico inervação alvos periféricos e um ramo central se estende para a medula espinhal. Lesão dos DRG resultados periféricos axônios em regeneração do axônio substancial, enquanto os axônios centrais na medula espinhal regenerar mal após a lesão. No entanto, se a lesão periférica axonal ocorre antes da lesão da medula espinal (um processo denominado a lesão condicionado), a regeneração de axónios centrais é greatly melhorado 4. Além disso, os axónios dos neurónios centrais DRG partilham o mesmo ambiente hostil como decrescente axónios corticoespinhais na medula espinal. Juntos, é a hipótese de que os mecanismos moleculares que controlam a regeneração do axônio dos neurônios adultos DRG pode ser aproveitado para melhorar a regeneração do axônio do SNC. Como resultado, os neurónios DRG adultos são agora largamente utilizado como um sistema modelo para estudar o crescimento axonal regenerativo 5-7. Aqui, descrevemos um método de cultura adulto neurónio de DRG que pode ser usado para o estudo genético de regeneração axonal in vitro. Neste modelo adulto neurônios DRG são geneticamente manipulados por meio de eletroporação transfecção mediada gene 6,8. Por transfecção de neurônios com DNA plasmídeo ou SI / shRNA, esta abordagem permite que as duas de ganho e perda de função de experimentos para investigar o papel de qualquer gene de interesse no crescimento do axônio dos neurônios DRG adultos. Quando os neurónios são transfectadas com SI / shRNA, a proteína endógena é orientadageralmente empobrecido após 3-4 dias em cultura, tempo durante o qual o crescimento axonal robusto já tenha ocorrido, tornando os estudos de perda de função-menos eficaz. Para resolver este problema, o método aqui descrito inclui um passo re-suspensão e re-plating após a transfecção, o que permite axónios de voltar a crescer a partir de neurónios na ausência da proteína alvo. Finalmente, fornecemos um exemplo da utilização deste modelo in vitro para estudar o papel de um gene axónio regeneração-associado, c-Jun, na mediação crescimento axonal de adulto DRG neurónios 9.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para o estudo genético de regeneração do axônio usando cultivadas adultos do mouse dorsal neurônios do gânglio da raiz é descrito. O método inclui um passo re-suspension/re-plating para permitir re-crescimento axonal a partir de neurónios submetidos a manipulação genética. Esta abordagem é especialmente útil para a perda de função de estudos de regeneração axonal utilizando RNAi baseado knockdown proteína.

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Um In vitro Modelo para o estudo genético de regeneração do axônio usando cultivadas adultos do mouse dorsal neurônios do gânglio da raiz é descrito. O método inclui um passo re-suspension/re-plating para permitir re-crescimento axonal a partir de neurónios submetidos a manipulação genética. Esta abordagem é especialmente útil para a perda de função de estudos de regeneração axonal utilizando RNAi baseado knockdown proteína.

Vídeo: Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsal Root Ganglia neurônios e células-tronco diferenciadas adiposo-derivados: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultura modelo para estudar a regeneração do nervo periférico

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Neurociência

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Uso de neurônios hipocampais primários para estudar a montagem de segmentos iniciais de Axon

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualização da Dinâmica do Cone de Crescimento e Crescimento do Axon em Culturas agudas de fatias de cérebro embrionário ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...