Este trabalho foi financiado por subsídios da Associação Francesa contre les myopathies (AFM-Téléthon) e da Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

<ol>
	<li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries.">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li><li>Fuster-Garc&#237;a, C., Garc&#237;a-Boh&#243;rquez, B., Rodr&#237;guez-Mu&#241;oz, A., Mill&#225;n, J. M., Garc&#237;a-Garc&#237;a, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies.">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473 (2020).</li><li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutics:+current+challenges+and+future+applications.">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing.">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li><li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system.">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li><li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes.">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li><li>Marty, I., Faur&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies.">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick,+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel.">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li><li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins.">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li><li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dusty+core+disease'+(DuCD):+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies.">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).</li><li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle.">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li><li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function.">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).</li><li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+(p.Y4864H)+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein.">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li><li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+old+and+the+new:+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology.">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103 (2020).</li><li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering,+communicating,+and+engineering+the+CRISPR+PAM.">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , (2006).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Um grande passo no caminho para a caracterização de genes de função desconhecida envolvidos em patologias é o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para estudar a função desses genes. O uso da edição de genes usando CRISPR/Cas9 é um campo de pesquisa em crescimento exponencial, e o desenvolvimento de modelos de knock-out como apresentado aqui está entre suas aplicações mais utilizadas. Nesse contexto, propomos aqui um protocolo versátil para desenvolver uma linha celular humana em qualquer gene de...

Com o progresso do sequenciamento genético e a identificação de mutações em genes de funções desconhecidas em um tecido específico, o desenvolvimento de modelos celulares relevantes para entender a função de um novo gene alvo e confirmar seu envolvimento nos mecanismos fisiodicos relacionados constitui uma ferramenta essencial. Além disso, esses modelos são de grande importância para futuros desenvolvimentos terapêuticos 1,2, constituindo uma alternativa interessante para o desenvolvimento de modelos animais nocautes em linha reta com as recomendações internacionais para redução do uso de animais na experimentação. A edição de genes usando CRISPR/Cas9 está entre as ferramentas mais poderosas disponíveis atualmente, o que permitiu o desenvolvimento de muitos modelos knock-out/knock-in, e a validação de genes direcionada usando CRISPR/Cas9 está entre as aplicações mais utilizadas do CRISPR/Cas93. O sucesso da edição de genes baseia-se na capacidade de introduzir as ferramentas CRISPR (o guia RNAs e o nuclease Cas9) no modelo de célula alvo, o que pode ser um desafio em muitas células difíceis de transfectar, como as células musculares4. Esse desafio pode ser superado com o uso do vírus, geralmente o lentivírus, que tem a grande vantagem de transduzir eficientemente muitos tipos de células e entregar seu transgene. Mas sua maior desvantagem é a integração do transgene no genoma da célula hospedeira, levando a uma possível alteração de genes localizados no local de integração e à expressão permanente do transgene, o que no caso do nuclease Cas9 resultaria em consequências prejudiciais5. Uma solução inteligente foi proposta por Merienne e seus colegas6, que consiste em introdução nas células de um guia-RNA visando o próprio gene Cas9, levando à inativação cas9. Uma adaptação dessa estratégia é apresentada aqui como um protocolo fácil de usar e versátil, permitindo eliminar praticamente qualquer gene em células difíceis de transfetar.
O objetivo do protocolo aqui apresentado é induzir a inativação de um gene de interesse em células musculares imortalizadas. Pode ser usado para eliminar qualquer gene de interesse.em diferentes tipos de células imortalizadas. O protocolo descrito aqui contém etapas para projetar os RNAs guia e sua clonagem em plasmídeos lentiviral, para produzir as ferramentas CRISPR em vetores lentivirais, para transdutar as células com os diferentes lentivírus, e para clonar as células para produzir uma linha celular homogênea editada.
Usando este protocolo, células musculares esqueléticas humanas imortalizadas foram desenvolvidas com a exclusão do receptor ryanodine tipo 1 (RyR1), um canal essencial de cálcio envolvido na liberação intracelular de cálcio e contração muscular7. O knock-out (KO) do gene foi confirmado no nível de proteína usando a mancha ocidental, e no nível funcional usando imagens de cálcio.

<table><tbody><tr><td>Anti-CACNA1S antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td><td>Takara</td><td>631312&amp;nbsp;</td><td>Transfection kit</td></tr><tr><td>Easy blot anti Mouse IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP secondary antibody</td></tr><tr><td>Easy blot anti Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP secondary antibody</td></tr><tr><td>Fluo-4 direct</td><td>Molecular Probes</td><td>F10472</td><td>Calcium imaging</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Restriction enzyme</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Ligation kit</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain antibody</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&amp;nbsp;740424</td><td>Maxipreparation kit for purification of plasmids</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>Kit for DNA extraction from cell</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&amp;nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemically competent cells</td></tr><tr><td>Plasmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plasmid #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)</td></tr><tr><td>Plasmid #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL</td></tr><tr><td>Plasmid #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles</td></tr><tr><td>V5 Tag Monoclonal Antibody</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&amp;nbsp;</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Chemically competent cells</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Restriction enzyme</td></tr></tbody></table>

development of knock-out muscle cell lines using lentivirus-mediated crispr/cas9 gene editing

Uma importante aplicação de repetições palindômicas interespaçadas interespaçadas (CRISPR)/Cas 9 é o desenvolvimento de linhas celulares knock-out, especificamente para estudar a função de novos genes/proteínas associados a uma doença, identificada durante o diagnóstico genético. Para o desenvolvimento dessas linhas celulares, duas questões principais devem ser desemaranhadas: inserção das ferramentas CRISPR (o Cas9 e o guia RNA) com alta eficiência nas células escolhidas, e restrição da atividade Cas9 à exclusão específica do gene escolhido. O protocolo descrito aqui é dedicado à inserção das ferramentas CRISPR em células difíceis de transfeito, como células musculares. Este protocolo baseia-se no uso de lentivírus, produzidos com plasmídeos disponíveis publicamente, para os quais todas as etapas de clonagem são descritas para atingir um gene de interesse. O controle da atividade cas9 tem sido realizado usando uma adaptação de um sistema descrito anteriormente chamado KamiCas9, no qual a transdução das células com um lentivírus codificando um guia de RNA visando o Cas9 permite a abolição progressiva da expressão Cas9. Este protocolo tem sido aplicado ao desenvolvimento de uma linha de células musculares humanas RYR1-knock out, que tem sido ainda caracterizada no nível proteico e funcional, para confirmar o nocaute deste importante canal de cálcio envolvido na liberação de cálcio intracelular muscular e no acoplamento excitação-contração. O procedimento descrito aqui pode ser facilmente aplicado a outros genes em células musculares ou em outras células difíceis de transfeito e produzir ferramentas valiosas para estudar esses genes em células humanas.

Este protocolo foi aplicado a míbios imortalizados de um sujeito saudável15 (as chamadas células HM, para míbios humanos), em que o RyR1 foi anteriormente caracterizado16, a fim de derrubar o gene RYR1 codificando a proteína RyR1. O design dos guias RNA foi feito para excluir a sequência que abrange parte do exon 101 e intron 101 do gene. A exclusão de parte do exon 101 está prevista para resultar em interrupção do quadro de leitura. Além disso, o exon 1...

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Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

O protocolo descreve como gerar myoblasts knock-out usando CRISPR/Cas9, desde o design de guide-RNAs até a clonagem celular e caracterização dos clones knock-out.

Desenvolvimento de linhas de células musculares knock-out usando edição de genes CRISPR/Cas9 mediados por lentivírus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Este protocolo permite o desenvolvimento de nocaute celular muscular em qualquer gene, a fim de estudar melhor a função deste gene no músculo. A vantagem é que é barato e mais rápido do que o desenvolvimento de animais nocautes para estudar qualquer gene. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, para estudar o envolvimento de um gene recém-identificado em uma miopatia.Se a técnica descrita aqui for aplicada às células iPS, pode levar ao desenvolvimento de células eliminatórias para qualquer gene em qualquer tipo de células. Para começar a agrupar-se regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas ou exclusão genética mediada pelo CRISPR, primeiro use ferramentas de navegador de genoma como ensembl. org para identificar o gene alvo, juntamente com as sequências de DNA em ambos os lados dele.Para obter a lista dos exons genéticos, primeiro clique na transcrição da sequência de codificação de proteínas e, em seguida, em Exons. Em seguida, clique na sequência de download e selecione apenas sequência genômica para baixar a sequência de consenso completa de todo o gene. Role a lista dos exons e introns do gene para selecionar os alvos.Para projetar o RNA guia, selecione primeiro sequências nucleotídeas dos introns imediatamente rio acima e rio abaixo da sequência de destino. Em seguida, vá para um site como crispr.tefor. net e use as sequências selecionadas para projetar dois RNAs guia, cada 20 nucleotídeos de comprimento sem o Protospacer Adjacent Motif separado por algumas centenas de pares de base.Em seguida, determine a sequência de complemento reverso para cada RNA guia e peça os primers. Para construir RNA guia para clonagem de plasmídeos, primeiro execute um PCR com um conjunto de primers usando a receita e o programa descrito no texto, em seguida, separe os produtos PCR em gel de 1%agarose usando o buffer Tris-borate-EDTA. Em seguida, extirpa o fragmento do par de 300 bases e purificar usando um kit.Da mesma forma, depois de executar outro PCR com o outro conjunto de primer, purifique um fragmento de DNA longo de 400 bases em 20 microliters de tampão de elução. Para inserir as fitas guia RNA em uma espinha dorsal plasmida lentiviral, primeiro configure uma reação de digestão dupla do plasmídeo com as enzimas de restrição Xma 1 e Blp 1, conforme descrito no texto. Depois de incubar o tubo de reação a 37 graus Celsius por uma hora, incuba-o a 65 graus Celsius por 20 minutos, depois execute o produto de digestão em um gel de 1% de agarose e purifique o plasmid de cerca de 10 pares de quilobase usando um kit apropriado.Também quantifique o produto purificado medindo a densidade óptica. Para ligar o guia RNA com o plasmídeo, prepare uma mistura de reação com o guia purificado RNA, o DNA plasmídeo linearizado, enzima e água para um volume final de 10 microliters, em seguida, incubar o tubo de reação a 50 graus Celsius por 15 minutos para gerar o plasmídeo final, chamado pGuide. Para a produção de lentivírus, primeiro semente uma placa de 145 centímetros com 1 milhão de células HEK 293 em DMEM com alta glicose e piruvato suplementado com 10% FBS e 1%penicilina ou estreptomicina.Em seguida, cresça as células a 37 graus Celsius por três dias em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. No quarto dia verifique as células para garantir 60 a 65% de confluência. Em seguida, prepare a solução de transfecção constituída pelo plasmídeo de interesse, a codificação plasmida do envelope do vírus, a embalagem lentiviral plasmid psPAX2 e fosfato de cálcio.Ajuste o volume final para 1000 microliters com água. Em seguida, adicione a solução de transfecção dropwise a um mililitro de 2X HBS sob agitação e incubar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Depois disso, adicione a solução dropwise às células.Para uma distribuição homogênea da solução de transfecção, incline suavemente a placa em todas as direções e, em seguida, incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por pelo menos cinco horas. Em seguida, remova a mídia das placas e lave as células com PBS para se livrar dos reagentes de transfecção, em seguida, adicione 12 mililitros de meio fresco. Após 48 horas de incubação a 37 graus Celsius, acumule a mídia de todas as placas em um tubo.Coloque o tubo em um balde selado e centrífuga a 800 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, depois filtre o supernascer usando um filtro de 0,45 micrômetro e centrifugar o filtrado a 68, 300 vezes G por duas horas a quatro graus Celsius, usando um rotor de balde balançando. Depois de remover o supernasce, mantenha os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel em um armário de segurança por cinco a 10 minutos para a remoção máxima do líquido das pelotas. Adicione 100 microliters de meio de proliferação hec e mantenha os tubos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas.Em seguida, resuspende a pelota por pipetação. Depois de coletar todas as pelotas resuspended, faça alíquotas de 10 ou 25 microliters, em seguida, armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius depois de encaixar o congelamento em hidrogênio líquido. Para a transdução myoblast, primeira semente cada poço de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de meio de proliferação contendo 10.000 células myoblast.No dia seguinte, adicione volumes pré-calculados de guias LV e LV Cas9 às células em um gabinete de segurança. Após cinco dias de incubação, solte as células do poço adicionando trippsina. Depois de contar os números de células, transfira as células de poços com confluência de 40 a 50% para uma nova placa.Após cinco horas de incubação, adicione volumes calculados de LV killer em uma multiplicidade de infecção de 20 e incubar por cinco a 10 dias ou pelo menos duas passagens no meio. Para caracterização funcional dos clones editados por genes por imagem de cálcio, placa 50.000 células no centro de um prato de 35 milímetros revestido de laminina. Para induzir a diferenciação, adicione o meio de diferenciação conforme descrito no texto.Após seis dias de incubação, tire o meio de cultura e delineie as células com uma caneta hidrofóbica. Em seguida, adicione 50 microliters de Fluo-4 Direct, diluídos um-para-um em meio de diferenciação, aos miotubos diferenciados. Depois de incubar os pratos a 37 graus Celsius por 30 minutos, lave as células duas vezes com tampão krebs suplementado com um miligrama por mililitro de glicose.Em seguida, use um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal com um objetivo de 10X para medir as variações de fluorescência a uma taxa de um quadro por segundo durante 90 segundos e escolher um campo com pelo menos 10 miotubes. Depois de remover o tampão krebs adicional, estimule as células com dois mililitros de cloreto de potássio para despolarização de membrana ou dois mililitros de metacresol florocloro ou 4CmC ou estimulação direta RyR1. Visualize a variação da fluorescência após a estimulação, em seguida, quantifique a variação de fluorescência em cada miotube.Este protocolo poderia ser usado com sucesso para eliminar o gene RyR1 dos míobios humanos, o que resultou em DNA genômico mais curto nas células. O nocaute de RyR1 também foi confirmado no nível da proteína, pois a proteína RyR1 não pôde ser detectada nas células-alvo por manchas ocidentais. A ausência de atividade RyR1 em miótubos diferenciadas das células eliminatórias ryR1 foi verificada ainda por imagens de cálcio Fluo-4 após estimulação direta de RyR1 por 4CmC ou estimulação indireta por despolarização de membrana induzida por cloreto de potássio.A sequência que será suprimida deve ser necessária para a previsão de uma proteína funcional. Esta técnica é ideal para o desenvolvimento de ferramentas pós-genômicas para estudar o envolvimento de novos genes em doenças musculares.

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