Este protocolo permite o desenvolvimento de nocaute celular muscular em qualquer gene, a fim de estudar melhor a função deste gene no músculo. A vantagem é que é barato e mais rápido do que o desenvolvimento de animais nocautes para estudar qualquer gene. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, para estudar o envolvimento de um gene recém-identificado em uma miopatia.
Se a técnica descrita aqui for aplicada às células iPS, pode levar ao desenvolvimento de células eliminatórias para qualquer gene em qualquer tipo de células. Para começar a agrupar-se regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas ou exclusão genética mediada pelo CRISPR, primeiro use ferramentas de navegador de genoma como ensembl. org para identificar o gene alvo, juntamente com as sequências de DNA em ambos os lados dele.
Para obter a lista dos exons genéticos, primeiro clique na transcrição da sequência de codificação de proteínas e, em seguida, em Exons. Em seguida, clique na sequência de download e selecione apenas sequência genômica para baixar a sequência de consenso completa de todo o gene. Role a lista dos exons e introns do gene para selecionar os alvos.
Para projetar o RNA guia, selecione primeiro sequências nucleotídeas dos introns imediatamente rio acima e rio abaixo da sequência de destino. Em seguida, vá para um site como crispr.tefor. net e use as sequências selecionadas para projetar dois RNAs guia, cada 20 nucleotídeos de comprimento sem o Protospacer Adjacent Motif separado por algumas centenas de pares de base.
Em seguida, determine a sequência de complemento reverso para cada RNA guia e peça os primers. Para construir RNA guia para clonagem de plasmídeos, primeiro execute um PCR com um conjunto de primers usando a receita e o programa descrito no texto, em seguida, separe os produtos PCR em gel de 1%agarose usando o buffer Tris-borate-EDTA. Em seguida, extirpa o fragmento do par de 300 bases e purificar usando um kit.
Da mesma forma, depois de executar outro PCR com o outro conjunto de primer, purifique um fragmento de DNA longo de 400 bases em 20 microliters de tampão de elução. Para inserir as fitas guia RNA em uma espinha dorsal plasmida lentiviral, primeiro configure uma reação de digestão dupla do plasmídeo com as enzimas de restrição Xma 1 e Blp 1, conforme descrito no texto. Depois de incubar o tubo de reação a 37 graus Celsius por uma hora, incuba-o a 65 graus Celsius por 20 minutos, depois execute o produto de digestão em um gel de 1% de agarose e purifique o plasmid de cerca de 10 pares de quilobase usando um kit apropriado.
Também quantifique o produto purificado medindo a densidade óptica. Para ligar o guia RNA com o plasmídeo, prepare uma mistura de reação com o guia purificado RNA, o DNA plasmídeo linearizado, enzima e água para um volume final de 10 microliters, em seguida, incubar o tubo de reação a 50 graus Celsius por 15 minutos para gerar o plasmídeo final, chamado pGuide. Para a produção de lentivírus, primeiro semente uma placa de 145 centímetros com 1 milhão de células HEK 293 em DMEM com alta glicose e piruvato suplementado com 10% FBS e 1%penicilina ou estreptomicina.
Em seguida, cresça as células a 37 graus Celsius por três dias em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. No quarto dia verifique as células para garantir 60 a 65% de confluência. Em seguida, prepare a solução de transfecção constituída pelo plasmídeo de interesse, a codificação plasmida do envelope do vírus, a embalagem lentiviral plasmid psPAX2 e fosfato de cálcio.
Ajuste o volume final para 1000 microliters com água. Em seguida, adicione a solução de transfecção dropwise a um mililitro de 2X HBS sob agitação e incubar em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Depois disso, adicione a solução dropwise às células.
Para uma distribuição homogênea da solução de transfecção, incline suavemente a placa em todas as direções e, em seguida, incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por pelo menos cinco horas. Em seguida, remova a mídia das placas e lave as células com PBS para se livrar dos reagentes de transfecção, em seguida, adicione 12 mililitros de meio fresco. Após 48 horas de incubação a 37 graus Celsius, acumule a mídia de todas as placas em um tubo.
Coloque o tubo em um balde selado e centrífuga a 800 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius, depois filtre o supernascer usando um filtro de 0,45 micrômetro e centrifugar o filtrado a 68, 300 vezes G por duas horas a quatro graus Celsius, usando um rotor de balde balançando. Depois de remover o supernasce, mantenha os tubos de cabeça para baixo em uma toalha de papel em um armário de segurança por cinco a 10 minutos para a remoção máxima do líquido das pelotas. Adicione 100 microliters de meio de proliferação hec e mantenha os tubos a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas.
Em seguida, resuspende a pelota por pipetação. Depois de coletar todas as pelotas resuspended, faça alíquotas de 10 ou 25 microliters, em seguida, armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius depois de encaixar o congelamento em hidrogênio líquido. Para a transdução myoblast, primeira semente cada poço de uma placa de 96 poços com 100 microlitros de meio de proliferação contendo 10.000 células myoblast.
No dia seguinte, adicione volumes pré-calculados de guias LV e LV Cas9 às células em um gabinete de segurança. Após cinco dias de incubação, solte as células do poço adicionando trippsina. Depois de contar os números de células, transfira as células de poços com confluência de 40 a 50% para uma nova placa.
Após cinco horas de incubação, adicione volumes calculados de LV killer em uma multiplicidade de infecção de 20 e incubar por cinco a 10 dias ou pelo menos duas passagens no meio. Para caracterização funcional dos clones editados por genes por imagem de cálcio, placa 50.000 células no centro de um prato de 35 milímetros revestido de laminina. Para induzir a diferenciação, adicione o meio de diferenciação conforme descrito no texto.
Após seis dias de incubação, tire o meio de cultura e delineie as células com uma caneta hidrofóbica. Em seguida, adicione 50 microliters de Fluo-4 Direct, diluídos um-para-um em meio de diferenciação, aos miotubos diferenciados. Depois de incubar os pratos a 37 graus Celsius por 30 minutos, lave as células duas vezes com tampão krebs suplementado com um miligrama por mililitro de glicose.
Em seguida, use um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal com um objetivo de 10X para medir as variações de fluorescência a uma taxa de um quadro por segundo durante 90 segundos e escolher um campo com pelo menos 10 miotubes. Depois de remover o tampão krebs adicional, estimule as células com dois mililitros de cloreto de potássio para despolarização de membrana ou dois mililitros de metacresol florocloro ou 4CmC ou estimulação direta RyR1. Visualize a variação da fluorescência após a estimulação, em seguida, quantifique a variação de fluorescência em cada miotube.
Este protocolo poderia ser usado com sucesso para eliminar o gene RyR1 dos míobios humanos, o que resultou em DNA genômico mais curto nas células. O nocaute de RyR1 também foi confirmado no nível da proteína, pois a proteína RyR1 não pôde ser detectada nas células-alvo por manchas ocidentais. A ausência de atividade RyR1 em miótubos diferenciadas das células eliminatórias ryR1 foi verificada ainda por imagens de cálcio Fluo-4 após estimulação direta de RyR1 por 4CmC ou estimulação indireta por despolarização de membrana induzida por cloreto de potássio.
A sequência que será suprimida deve ser necessária para a previsão de uma proteína funcional. Esta técnica é ideal para o desenvolvimento de ferramentas pós-genômicas para estudar o envolvimento de novos genes em doenças musculares.
