Подготовка и культуры Крыса объектива Эпителиальные эксплантов для изучения терминальной дифференцировки

Резюме

Эксплантатов центральной части линзы эпителия крысы дифференцировать синхронно при культивировании в присутствии FGF-2. Иммунофлуоресценции микроскопии таких культур могут предоставляет новые сведения о экспрессии генов и сигнальных событий, связанных с терминальной дифференцировки.

Аннотация

Передней поверхности глазных линз покрыта монослой эпителиальных клеток, которые размножаются в кольцевой зоне, лежащей в основе цилиарного тела. После разделения, эти клетки мигрируют в задней части, где FGF диффундирующих от сетчатки побуждает их к дифференцировке в задней массив удлиненной линзы волокна клеток, которые составляют основную часть линзы. Дифференциация объектив эпителиальных клеток в объектив волокна могут быть вызваны в пробирке путем культивирования эксплантатов центральной части переднего эпителия в присутствии FGF-2. Эксплантов готовятся из линз у новорожденных крыс, удаляя линзы из глаз и схватив капсулы хрусталика на задней стороне рассекает пинцетом. Задней капсулы затем аккуратно порваны и нажал вниз, в нижней части пластиковой блюдо культуры ткани. Периферийных областях эксплантов удаляются с помощью скальпеля и центральной площади, затем культивировали в присутствии 100ng/ml FGF-2 так долго, как 2-3 недель, в зависимости от параметров, которые будут изучены. С эпителиальных клеток в культуре эксплантов дифференцироваться в приближенных синхронность в течение дней или недель, время хода сигнализации и экспрессии генов можно определить с помощью молекулярных, биохимических и фармакологических методов. Иммунофлуоресценции микроскопия является мощным дополнением к этим методам, как это демонстрирует внутриклеточную локализацию белков интереса и может выявить физиологические последствия экспериментальных манипуляций сигнальных путей.

протокол

Часть 1: Снятие линзы

Материалы и реактивы:

1. Микро-анатомические ножницы, изогнутые, тупые советы, (например as.RS-5983, Roboz Хирургическое машиностроительный завод, Inc, Gaithersburg, MD), микро-рассечение пинцет, изогнутый наконечник (таких, как Roboz # RS5137).
2. Подвеска среды: Средний 199, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 100 ед / мл пенициллина, стрептомицина 100μg/ml, 2,5 мкг / мл амфотерицина Б. Реагенты доступны из Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния.

Порядок действий:

1. Эвтаназии новорожденных крыс (в возрасте 2-4 дней) в соответствии с указаниями Национального Института Здоровья, Bethesda, MD.
2. Удалить веки с хирургическими ножницами. Пресса осторожно пинцетом с изогнутыми по разные стороны глазницы, чтобы заставить глаза на выпуклость наружу. Сделайте небольшой надрез на задней стороне глаза с ножницами. При нажатии пинцетом против стороне глаза напротив разреза, объектив и небольшое количество присоединенных тела стекловидного может быть принужден через разрыв, что позволяет объектив, чтобы ее взяли с изогнутым пинцетом. Следует проявлять осторожность, чтобы не сломать капсулы хрусталика.
3. Используйте изогнутый пинцет для передачи линзы 60мм пластиковая тарелка культуре ткани, содержащей 5 мл теплой, стерильной среде подвески.

Часть 2: микродиссекция эксплантов

Материалы и реактивы:

1. Micro Пройдя пинцет, 0,1 советы мм, (таких как Roboz RS-4976). Мы используем Dumostar сплава из-за гибкости кончика, но и других сплавов стали также являются приемлемыми. Пинцет с советами тоньше, чем 0,1 мм не рекомендуется, поскольку они имеют тенденцию сломать или согнуть во время этой процедуры.
2. Подвеска среды (см. Часть 1)
3. Unsupplemented F12 среда Хэма или средний 199 (Invitrogen, Carlsburg, Калифорния)

Порядок действий:

1. Следующие шаги должны быть проведены в чистом, без сквозняков среды с использованием стерильных инструментов и рассекает стерильной среде.
2. Использование стерео-рассекает микроскоп, чистые линзы каких-либо приставших ткани с 0,1 мм кончике пинцета и передавать их на второй 60мм блюдо культуры, содержащие 5 мл стерильной среде подвески (этот шаг способствует снижению загрязнения). С помощью пинцета, передачи желаемого числа линз в 35-мм блюдо культуры, содержащие 5 мл стерильного, unsupplemented среды. (Мы часто используют F12 Хэма (Invitrogen) за этот шаг, потому что ниже концентрации красителя делает рассечение проще, однако, средняя 199 также приемлемо Нет антибиотики или другие дополнения, необходимые во время этого шага..) Целых 12 эксплантатов могут быть сделаны В центре блюда такого размера. Тем не менее, 35 мм блюдо должно быть использовано, даже если меньше эксплантов должны быть сделаны, потому что рассечение инструментов нельзя манипулировать легко в меньшей блюдо. Передача блюдо с оставшейся линзы культуры тканей инкубаторе при температуре 37 ° С, пока они не нужны.
3. Определить задней стороне линзы. Есть много способов, чтобы признать это: 1) задние является круглее, чем передняя, ​​что несколько уплощенная, 2) новорожденных крыс форма линз холодной катаракты, как они охлаждают до комнатной температуры во время вскрытия. Если холодно катаракты не полностью заполнены объектива, задняя сторона сторону дальней от непрозрачного региона. Если непрозрачность заполнил объектив, потепление блюдо до 37 ° С в течение нескольких минут будет повернуть его вспять. Задняя сторона может быть определена как катаракта реформ при охлаждении. 3) Остатки оболочки vasculosa Lentis могут быть видны на задней стороне. 4) задний шов могут быть видны на задней стороне. Определение задней стороне правильно имеет важное значение, поскольку именно там капсула будет открыта. Открытие линзы на передней стороне порвется эпителия.
4. Как только задняя сторона была определена, поверните его вверх и обхватите линзы в левой пинцет (для правого работника). Затем щепотка задней капсулы с правом пинцет, чтобы производить небольшие складки.
5. Удерживая задней капсулы с правом пинцет, возьмите складку капсулы с левой пинцетом и вытащить две пары пинцетов в противоположных направлениях, чтобы сделать небольшой разрыв в капсуле.
6. Хотя схватив край втягивания капсулу с пинцета, тянуть его вниз, сначала на одну сторону, потом на другой, прижимая его в пластиковый сосуда с помощью пинцета. Повторите это несколько раз, перемещаясь по всему экватору хрусталика, пока капсула прочно прикреплены к пластине во многих точках. Холдинг капсулы на месте с левой пинцетом, осторожно встряхнуть массы волокна с правом пинцет, чтобы разорвать привязанность волокна клеток и клеток эпителия в объектив экватора. Затем нажмите массы волокна прочь, прокат его от капсулы / эпителия, который остается прикрепленной к нижней частиблюдо. Продолжайте этот процесс со всеми линзами в блюдо. Удаляют волокна масс (или сохранить их замороженные в качестве источника белков линзы для других исследований).

Часть 3: микродиссекция и культуры центральных эксплантов

Материалы и реактивы:

1. Стерильный одноразовый скальпель, лезвие № 15, (Цинциннати Хирургическое Ко Цинциннати, Огайо)
2. Стерильные фосфатным буферным солевым раствором с кальцием и магнием (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния)
3. Культура среда: Подвеска среде, содержащей 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc Сент-Луис, Миссури).

Порядок действий:

1. Используя стерильный скальпель, обрежьте периферических эпителия (ПЭ), который содержит клетки на ранних стадиях дифференцировки (рис. 1А), в результате чего центральная площадь около 2,0 мм на сторону, состоящую из центральной клетки эпителия только (CE) (рис. 1В).
2. Передача блюдо с центральным эксплантов для кабинета биобезопасности. Промыть 3 раза стерильной PBS, содержащих кальций и магний, и один раз с 1 мл свежей, уравновешенной (37 ° C, 5% СО ₂₎ подвески среды. Эти моет значительно снизить вероятность заражения.
3. Добавить 2 мл культуральной среды, чтобы побудить дифференциация ^1, и место эксплантов в увлажненной, тканевая культура инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% СО _2. Культура периоды могут быть как несколько часов или продлить в течение двух-трех недель, в зависимости от параметра изучается. Средний следует менять каждые два-три дня.

Часть 4: Заготовка эксплантов для анализа событий, связанных с дифференциацией

1. Сбор эксплантов для анализа белков или РНК

Материалы по теме:

1. Microdissecting пинцет
2. SDS Лизис буфера или РНК-позже

Порядок действий:

1. В конце инкубации удалить питательную среду.
2. Использование стерео-рассекает микроскопом, осторожно освободите края каждого эксплантов.
3. Поднимите каждый эксплантов с пинцетом и перенести его на трубке, содержащей около 100 мкл SDS лизирующего буфера (для анализа белков) или РНК-более поздней версии (для анализа РНК). Перемешивают кончике пинцета в раствор, чтобы эксплантов не прилипает к пинцетом.

2. Сбор эксплантов для иммунофлуоресценции

Материалы и реактивы:

1. Фосфатным буферным солевым раствором с кальцием и магнием (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния)
2. Фосфатным буферным раствором (без кальция и магния) (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния)
3. 4% параформальдегида (Бостон биопродуктов, Вустер, Массачусетс)
4. Microdissecting пинцет
5. Гидрофобные маркером
6. Слайды стекло микроскопа
7. 0,25% Тритон Х-100 в фосфатным буферным раствором.

Порядок действий:

1. Промыть эксплантов кратко в PBS, содержащих кальций и магний.
2. Fix тканей, добавив 4% параформальдегида в течение 30 минут при комнатной температуре.
3. Снимите фиксатор и заменить фосфатным буферным раствором. Исправлена ​​эксплантов стало несколько жесткая, что позволяет им быть сняты и переданы в стеклах для иммунной окраски.
4. Место небольшую каплю PBS (без кальция и магния) на слайд, чтобы помочь позицию ткани и предотвращения скручивания. Использование microdissecting пинцет, поднимите эксплантов и вставить его в падение на слайде. Не касаясь эксплантов, тщательно удалить жидкость с бумаги фитиль, чтобы сгладить эксплантов на стекло и дайте ткани высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 3 до 5 минут.

Рисунок 1 А. периферических эпителия выражает дифференциации-специфических белков. Эксплантов был показан immunostained для N-кадгерина сразу после микродиссекции. Выражение наблюдается в группе клеток в периферической эпителия, указывающий, что клетки в этом регионе начали дифференцироваться. Б. периферических эпителий может быть урезана прочь, чтобы удалить клетки, которые экспрессируют N-кадгерина и других дифференциации-специфических белков. Красное кольцо представляет расположение клеток, которые экспрессируют N-кадгерина, а небольшая площадь, изложенные в сером представляет квадрант эпителия показано на панели 1А. Периферических эпителия могут быть удалены четыре скальпеля сокращений, в результате чего центральная площадь, которая содержит только клетки, которые еще не начали дифференцироваться.

Обсуждение

Эксплантов крысы объектив система успешно используется в ряде лабораторий для изучения терминальной дифференцировки клеток эпителия линзы к линзе волокна ^21,3,4,5. При контакте с FGF-2 в 100ng/ml эксплантов начнут показывать изменения в передаче сигналов в течение нескольких минут ^6, с изменениями в морфологии и экспрессии генов появляются последовательно в течение нескольких дней ^3,4,5. Культуры остаются жизнеспособными в течение 2-3 недель, если приняты меры для предотвращения загрязнения.

Центральной эксплантов указанных в настоящем Протоколе, особенно полезны для изучения последовательности событий, связанных с дифференциацией, так как они содержат мало, если вообще клетки, которые экспрессируют маркеры дифференциации до FGF-2 добавляется ^1,5. Затем клетки дифференцироваться синхронно, как когорты, что позволяет следить за ходом времени сигнализации и транскрипционной событий, связанных с дифференциацией. Культивирование эксплантов для различных периодов времени таким образом, обеспечивает точную информацию о временной последовательности событий. Конкретные ингибиторы могут быть добавлены в культуральной среде для выявления соответствующих сигнальных путей. Эксплантатов могут быть использованы для анализа экспрессии белка с помощью ДСН гель-электрофореза и иммуноблоттинга или для анализа экспрессии специфических мРНК ОТ-ПЦР. Белки доходность в диапазоне от 20-50 мкг / эксплантов и РНК доходность составляет приблизительно 200 - 600 нг / эксплантов, в зависимости от продолжительности периода культивирования. Как правило, мы обнаружили, что 5-6 эксплантов на чашку обеспечит достаточную белок или РНК в течение нескольких анализов. РНК из эксплантов также может быть использован для получения кДНК для оценки экспрессии генов с микрочипов анализа, который может идентифицировать новые гены, которые могут иметь решающее значение для дифференциации. Эксплантов может быть также трансфекции. Хотя эффективность трансфекции, как правило, низкая, это достаточно для опробования репортер генов ^{4, 7, 8.} Иммунофлуоресценции микроскопии эксплантов является полезным дополнением к биохимические методы определения внутриклеточной локализации белков, представляющих интерес. Таким образом, подготовка и культуры эксплантов крысы объектив обеспечивает мощная система для изучения дифференциации терминал линзы у млекопитающих, которые могут дополнять в естественных методов, таких как поколение трансгенных и нокаут мышей.