터미널 차별 유학을위한 준비 및 랫 렌즈 상피 Explants의 문화

요약

FGF - 2의 존재 양식 때 쥐 렌즈 상피 조직의 중심 지역의 Explants는 동기 구별. 이러한 문화의 Immunofluorescence 현미경은 유전자 발현 및 단말 차별과 연관된 신호 이벤트에 대한 소설 정보를 제공하실 수 있습니다.

초록

안구 렌즈의 앞쪽에 표면은 모양체를 기본 환상 영역에서 세포 분열 따위에 의해 번식 상피 세포의 monolayer로 덮여 있습니다. 망막에서 diffusing FGF 그들이 렌즈의 대량를 작성할 길쭉한 렌즈 섬유 세포의 후부 배열로 차별화 유도 어디 분할에 따라, 이들 세포는 뒤로 마이 그 레이션. 렌즈 섬유로 렌즈 상피 세포의 분화는 FGF - 2의 존재의 앞쪽에 상피의 중심 지역의 culturing의 explants에 의해 체외에서 유도된 수 있습니다. Explants은 안구의 렌즈를 제거하고 해부 핀셋으로 후부 측면에 렌즈 캡슐을 쥐고하여 신생아 쥐의 렌즈에서 준비가되어 있습니다. 후부 캡슐은 다음 부드럽게 열고 찢어진과 조직 문화 요리의 플라스틱 바닥에 내려 누르고있다. explant의 주변 지역은 메스로 제거하고 중앙 지역은 다음 공부하는 매개 변수에 따라, 한 2-3으로 주 100ng/ml FGF - 2의 존재 양식이다. 교양 explants의 상피 세포가 주 일 기간 동안 대략 synchrony의 차별 때문에, 신호 및 유전자 발현의 시간 코스는, 분자 생화학 및 약리 기술을 이용하여 결정하실 수 있습니다. 그것이 관심의 단백질의 subcellular 지방화을 보여주고 신호 경로의 실험 조작의 생리적 결과를 확인할 수 같이 Immunofluorescence 현미경이 방법은 강력한 부가됩니다.

프로토콜

1 부 : 렌즈의 제거

재료 및 시약 :

1. 마이크로 해부 가위, 곡선, 무딘 팁, (예 : as.RS - 5983, Roboz 외과 악기 (주) 부동산, 게이 더 스버그, MD), 마이크로 해부 핀셋, 곡선 팁 (예 : Roboz # RS5137 등).
2. 중지 매체 : 중간 199 소 혈청 100 단위, 알부민 / ML 페니실린 0.1 %, 100μg/ml의 스트렙토 마이신, 2.5 μg / ML Amphotericin B.의 시약을 포함 Invitrogen, 칼스 배드, CA에서 사용할 수 있습니다.

절차 :

1. 건강, 베데스다, MD 국립 연구소에서 제공하는 지침에 따라 신생아 쥐 (2-4일 세) 안락사.
2. 수술 가위로 눈꺼풀을 제거합니다. 바깥쪽으로 팽창에 눈을 강제로 눈을 소켓 반대편에 곡선 핀셋로 부드럽게 누르십시오. 가위로 눈 후부 측면에 작은 절개를합니다. 절개 반대 눈의 측면에 대한 족집게로 누르면, 렌즈와 부착된 유리 본체의 작은 금액은 다음 렌즈 곡선 핀셋로 데리러 수 있도록, 파열을 통해 밖으로 강제로 수 있습니다. 케어는 렌즈 캡슐을 깰하지 않도록해야합니다.
3. 5ml 따뜻하고 살균 서스펜션 매체를 포함하는 60mm 플라스틱 조직 문화 요리에 렌즈를 전송하는 곡선 핀셋을 사용합니다.

2 부 : explants의 Microdissection

재료 및 시약 :

1. 마이크로 분석 해 봅시다 족집게, 0.1 mm 팁 (예 Roboz RS - 4976 등). 우리는 때문에 팁의 유연성의 Dumostar 합금을 사용할 수 있지만 다른 철강 합금도 가능합니다. 그들은이 절차를 수행하는 동안 휴식이나 구부하는 경향으로 0.1mm 이상의 얇은 팁을 핀셋은 권장되지 않습니다.
2. 서스펜션 매체 (1 부 참조)
3. 햄의 F12 중간 또는 중간 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented

절차 :

1. 다음 단계는 살균 해부 도구 및 멸균 매체를 사용하여 청소, 초안이없는 환경에서 수행되어야합니다.
2. 스테레오 - 해부 현미경을 사용하여 0.1 mm 팁 핀셋있는 모든 준수 조직의 렌즈를 청소하고 5ml 살균 정지 매체 (이 단계는 오염을 줄이기 위해 도움)이있는 두 번째 60mm 문화 요리로 전송할 수 있습니다. 핀셋으로 5ml 살균, unsupplemented 매체를 포함하는 35mm 문화 요리에 렌즈의 원하는 번호를 전송합니다. (낮은 염료 농도가 해부 쉽게하기 때문에 우리는 종종이 단계 햄의 F12 (Invitrogen)을 사용되지만, 보통 199도 허용 않습니다 항생제 또는 다른 추가이 단계에서 필요하지 않습니다..) 12 explants이 이루어질 수있는만큼 많은 요리이 정도 크기의 중심 인치 적은 explants는 해부 도구를 작은 접시에 쉽게 넘어가지 수 없기 때문에, 만들 수 경우에도 그러나, 35mm 요리를 사용해야합니다. 37 조직 문화 인큐베이터로 남은 렌즈가 들어있는 접시를 전송 ° 그들이 필요한 C까지.
3. 렌즈의 후부 측면을 식별합니다. 이것을 인식하는 방법에는 여러 가지가 있습니다 : 1) 뒷부분이 약간 평평있는 앞쪽에보다 라운드 시합이며, 절개하는 동안 실내 온도와 같은 사람들이 시원한 2) 신생아 쥐 렌즈는 백내장 추위를 형성합니다. 추위 백내장 완전히 렌즈를 가득하지 않은 경우 사후 측면이 불투명 지역에서 먼 쪽입니다. 불투명도 37로 요리를 온난 화, 렌즈를 가득있는 경우 ° C 몇 분 동안 그것을 반대합니다. 후부 측면은 냉각시 백내장 개혁으로 확인하실 수 있습니다. 3) 투니카 vasculosa lentis의 흔적은 후부 측면에서 볼 수 있습니다. 4) 사후 치료는 사후 측면에서 볼 수 있습니다. 캡슐을 열 것입니다 어디에이이기 때문에 제대로 후부 측면을 확인하는 것은 필수입니다. 앞쪽에 측면에 렌즈를 여는 것은 상피 찢어 것입니다.
4. 뒷부분 측면이 확인되면 위쪽으로 그것을 설정하고 (오른손잡이 노동자의 경우) 왼쪽 핀셋에 렌즈를 파악. 그런 다음 작은 배 생산에 대한 권리 핀셋으로 후부 캡슐을 꼬집어.
5. 오른쪽 핀셋으로 후부 캡슐을 잡고있는 동안, 왼쪽 핀셋과 캡슐의 공간 이동을 파악하여 캡슐에 작은 균열을 만들어 반대 방향으로 족집게의 두 쌍을 가져옵니다.
6. 핀셋으로 retracting 캡슐의 가장자리를 쥐고 있지만, 핀셋으로 접시의 플라스틱으로 그것을 누르면, 다른 클릭한 다음, 한쪽에 먼저 아래로 당기세요. 캡슐 단단히 여러 지점에서 판에 부착된 때까지, 모든 렌즈의 적도 주변에 이동이 여러 번 반복합니다. 왼쪽 핀셋과 장소에서 캡슐을 잡고 부드럽게 렌즈 적도에서 섬유 세포와 상피 세포 사이의 첨부 파일을 깰 수있는 권리 핀셋으로 섬유 덩어리를 바위. 다음의 하단에 부착된 남아있는 캡슐 / 상피를 벗어 압연, 멀리 섬유 질량 밀어요리. 접시에있는 모든 렌즈와 함께이 과정을 계속합니다. 제거하고 섬유 대중 (또는 그들이 다른 연구에 대한 렌즈 단백질의 소스로 냉동 저장) 폐기.

파트 3 : Microdissection 및 중앙 explants 문화

재료 및 시약 :

1. 멸균 일회용 메스, # 15 블레이드 (신시내티 외과 주 신시내티, OH)
2. 멸균 인산은 칼슘과 마그네슘 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)를 살린 버퍼
3. 문화 매체 : 100ng/ml FGF - 2 (시그마 - 알드리치 (주) 세인트 루이스, MO)가 포함된 정지 매체.

절차 :

1. 멸균 메스를 사용하여 단 (CE) (그림에게 중앙 상피 세포로 구성된, 측면에서 중앙 광장에 약 2.0mm 떠나, 차별화 (그림 1A)의 초기 단계의 세포를 포함하는 주변 상피 (PE)를 멀리 트림 1B).
2. biosafety 캐비닛에 중앙 explants 들어있는 접시를 전송합니다. 멸균 PBS 신선한, equilibrated (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 정지 매체의 1ml로 한 칼슘, 마그네슘을 포함하고 3 번 씻으십시오. 이들은 크게 오염의 가능성을 줄일 수 씻는다.
3. 차별 ^하나를 유발하고, 37 humidified, 조직 문화 인큐베이터에 explants을 배치 문화 매체 2mL를 추가 ° C, 5 % CO _2. 문화 기간이 몇 시간처럼 짧은하거나 연구하는 매개 변수에 따라 한 2-3주로 확장할 수 있습니다. 매체는 2-3일마다 변경해야합니다.

4 부 : 차별과 연관된 이벤트의 분석에 explants의 착취

1. 단백질이나 RNA의 분석을위한 수확 explants

자료 :

1. Microdissecting 핀셋
2. SDS 용해 버퍼 또는 RNA - 나중에

절차 :

1. 잠복기의 끝에, 문화 매체를 제거합니다.
2. 스테레오 - 해부 현미경을 사용하여 부드럽게 각 explant의 가장자리를 느슨하게.
3. 핀셋 각 explant을 들어 100μl SDS의 용해 버퍼 (단백질 분석을 위해) 또는 RNA - 이상 (RNA 분석을위한)에 대한 포함된 튜브로 전송할 수 있습니다. explant가 핀셋에 집중하지 않도록하기 위해 솔루션에 핀셋의 끝부분을 선동하다.

2. immunofluorescence을위한 수확 explants

재료 및 시약 :

1. 인산은 칼슘과 마그네슘 (Invitrogen, 칼스 배드, CA)를 살린 버퍼
2. 인산가 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) (칼슘, 마그네슘 제외) 살린 버퍼
3. 4 % paraformaldehyde (보스톤 Bioproducts, 우스터, MA)
4. Microdissecting 핀셋
5. 소수성 마킹 펜
6. 유리 현미경 슬라이드
7. 0.25 % Triton은 인산의 X - 100 살린 버퍼.

절차 :

1. PBS는 칼슘과 마그네슘을 포함하는으로 간단히 explants 린스.
2. 실온에서 30 분 4 % paraformaldehyde를 추가하여 조직을 수정.
3. 정착액을 제거하고 인산은 생리 버퍼로 바꿉니다. 고정 explants 그들이 immunostaining에 대한 해제와 유리 슬라이드로 전송하므로 다소 딱딱하게된다.
4. 위치 조직을 도움 컬링을 방지하기 위해 슬라이드에 PBS의 작은 방울 (칼슘, 마그네슘 제외) 놓습니다. microdissecting 핀셋을 사용하여 explant를 들고 슬라이드에있는 드롭에를 삽입합니다. explant을 건드리지 않고, 조심스럽게 유리에 explant을 버리고 종이 심지로 액체를 제거하고 3-5분 위해 상온에서 공기에있는 조직이 건조하게.

그림 1 대답 : 주변 상피는 차별화 특정 단백질을 표현하고 있습니다. 표시된 explant는 즉시 microdissection 후 N - cadherin을위한 immunostained했다. 표현식은이 지역의 세포가 주변 상피가 세포를 제거하는 멀리 줄어들 수 있습니다. B.에게 차별하기 시작 것을 나타내는 주변 상피의 세포의 밴드에서 본 것을 표현 N - cadherin과 다른 차별화 특정 단백질. 빨간색 고리는 세포의 위치를​​ 나타내는 회색으로 나와있는 작은 광장이 패널 1A에 표시된 상피의 사분면을 나타내는 동시에 표현 N - cadherin. 주변 상피는 아직 구별하기 시작하지 않은 유일한 세포를 포함하는 중앙 광장을 떠나, 넷 메스 상처에 의해 제거할 수 있습니다.

토론

쥐 렌즈 explant 시스템은 성공적으로 렌즈 섬유 ^21,3,4,5에 렌즈 상피 세포의 터미널 차별을 연구하는 실험실의 숫자가 사용되었습니다. 100ng/ml에서 FGF - 2에 노출하면 explants는 형태와 며칠 동안 순차적으로 ^3,4,5 나타나는 유전자 발현의 변화와 함께, 분 ^{6 시간내에} 신호의 변화를 보여주기 시작합니다. 치료가 오염을 방지하기 위해 촬영하는 경우에는 문화 2-3 주 동안 가능한 남아있다.

FGF - 2 이전에 분화 마커를 표현하는 세포가 ^1.5을 추가하는 경우 그들은 몇 가지가 포함부터이 프로토콜에 설명되어있는 중앙 explants는 차별과 연관된 이벤트의 순서를 공부에 특히 유용합니다. 세포가 그것이 가능한 차별과 연관된 신호 및 transcriptional 이벤트의 시간 과정을 따르도록하고, 군대로, 동기 구별. 시간이 서로 다른 길이에 대한 Culturing의 explants 따라서 순서 이벤트에 대한 정확한 시간적 정보를 제공합니다. 특정 저해제는 관련 신호 경로를 식별하는 문화 매체에 추가할 수 있습니다. Explants는 SDS 젤 전기 영동과 immunoblotting하여 단백질 발현을 분석하거나 RT - PCR에 의해 특정 mRNAs의 표현을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 시대의 길이에 따라 600 NG / explant - 20-50 μg / explant와 RNA 수율에서 단백질 수익률 범위는 약 200입니다. 우리는 일반적으로 요리마다 5-6 explants 몇 assays위한 충분한 단백질 또는 RNA를 제공할는 것을 발견했습니다. explants에서 RNA는 차별 화를위한 중요한 수 있습니다 소설 유전자를 식별할 수 microarray 분석에 의해 유전자 발현을 평가하기위한 cDNA를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. Explants도 transfected 수 있습니다. transfection 효율은 일반적으로 낮은이지만, 그것은 기자의 유전자에게 ⁴ 시금을하기에 ^{충분, 7, 8.} explants의 Immunofluorescence 현미경 관심의 단백질의 subcellular 위치를 결정하여 생화 학적 방법에 유용한 외래를 제공합니다. 따라서, 쥐 렌즈 explants의 준비와 문화는 유전자 변형 및 노크 아웃 마우스의 생성과 같은 생체내 기술에서 보완 할 수 포유류에서 터미널 렌즈 차별을 공부위한 강력한 시스템을 제공합니다.