Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)

Резюме

Этот протокол описывает изоляцию и последующее расширение мезенхимальных стромальных клеток и эндотелиальных клеток, образующих колонии без использования животного сыворотку для получения аутологичных пар в экспериментальных целях трансплантации.

Аннотация

Пуповины является богатым источником для клеток-предшественников, с высокой пролиферативной потенциал в том числе мезенхимальных стромальных клеток (также называемые мезенхимальные стволовые клетки, МСК) и эндотелиальных колониеобразующих клеток-предшественников (ECFCs). Оба типа клеток играют ключевую роль в поддержании целостности ткани и, вероятно, также участвует в восстановительных процессов и опухолей.

Для изучения их биологии и функции в сравнительной образом, важно иметь оба типа клетки можно получить и того же донора. Он также может быть полезным для восстановительных целей для получения МСК и ECFCs из той же ткани.

Поскольку сотовая терапии в конечном счете должны найти свой путь от скамьи к постели мы создали новый метод для изоляции и дальнейшему расширению клеток-предшественников, без использования животного белка. Объединенные человека лизат тромбоцитов (pHPL) заменил эмбриональной телячьей сыворотки на всех этапах нашего протокола, чтобы полностью избежать контакта клетки ксеногенных белков.

Это видео демонстрирует методику выделения и расширение клеток-предшественников из одной пуповины.

Все материалы и процедуры будут описаны.

протокол

Часть 1: Настройка

1. Подготовка клеточной среде культуры

Перед тем как начать подготовку среду собрать все материалы и инструменты вам понадобятся.
Оттепель 2 х 56 мл аликвоты объединенных тромбоцитов человека лизат (pHPL, самодельные: ссылка 1 и Юпитер # 1523), 10 мл 100x Пенициллин / стрептомицин решение, 2 х 5 мл L-глютамин (как Sigma).

Оттепель цитокинов и факторов роста аликвоты (VEGF, bFGF, EGF, IGF, гидрокортизон, аскорбиновая кислота, гепарин, амфотерицин предоставляется в качестве «единого quots ') с поправкой на дополняющие 1 бутылка (500 мл) EGM-2 среды (Lonza).

Из холодильника взять одну бутылку 500 мл каждая из (я) альфа-модифицированный минимальный необходимый среды (-MEM) и (II) эндотелиальной базальной среды (EBM).

Все последующие шаги выполняются в ткани ламинарным потоком капота культуры в стерильных условиях.

Подготовка без консервантов гепарина (например, Biochrom) путем растворения порошка в конечной концентрации 1000 МЕ / мл стерильной водой.

МСЦ-среда:

Используйте 500 мл-MEM, добавить 56 мл талой pHPL (см. также 1 для более подробной информации) и 2 МЕ / мл (= 224 мкл исходного раствора) консерванта без гепарина (избегает коагуляции среды, через слипания фибриногена в плазме), чтобы достичь конечной концентрации 10% pHPL. Кроме того, добавить пенициллин (100U/mL) / Стрептомицин (100μg/mL) решение и на 2 мм от L-глутамин (как Sigma).

Фильтры среды, через 20 мкм, размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).

ECFC-среда:

Используйте одну бутылку (500 мл) EBM, добавить цитокин-аликвоты, 56 мл pHPL, 10 МЕ / мл (= 1120μl запаса раствора) без консервантов гепарин, пенициллин (100U/mL) / стрептомицин (100 г / мл) раствора и 2 мм L-глутамин к базальной среды и фильтром с 20 мкл-размер пор вакуум-фильтра (Millipore). Этикетка бутылки соответствующим образом (содержание, дата).

2. Стерилизация хирургических инструментов

Пинцет, острый пара хирургических ножниц и скальпеля держатель должен быть тепло стерилизовать руды стерильных одноразовых изделий.

3. Подготовка труб для шнура коллекции

Добавить 500 МЕ консерванта - бесплатный гепарина на 50 мл полипропиленовые пробирки (Falcon) и приспосабливаться к окончательным объемом 20 мл с PBS. Передача трубы в родильном зале.

4. Информированное согласие (подтверждено вашим местным этическим комитетом или IRB).

Попросите родителей до родов, если они хотели бы пожертвовать частью мозга и адекватно информировать их о цели он будет служить.

5. Шнур пожертвование

После доставки и проверки плаценты и пуповинной отрезали 10 см кусок и сразу же перевести его на трубки заполнены с гепарином, чтобы избежать свертывания крови оставшихся внутри шнура судов. Продолжить с изолятор как можно скорее.

Часть 2: Сотовый изоляции

1. Подготовка ламинарного потока культуре ткани капот путем очистки поверхностей с Incidin или 70% этанола. Место стерильной 150 см ² клеточной культуре пластины, 75 см клеточных культур колбах (как Corning), PBS, стерилизовать хирургические инструменты, сотовые скребки, трубка держателя, 25 мл stripettes и 5 мл шприцы оснащены тупые иглы конца надлежащим образом в вашей очищены капотом.
2. Предварительно обогрева подготовлены α-MEM и EGM-2 ячейки культуральной среды до 37 ° С на водяной бане.
3. Принесите шнур от родильной палате в вашей лаборатории оснащены капот культуре клеток. После передачи шнур в ламинарный поток мыть дважды в PBS (путем перечисления на новые пластины), чтобы избавиться от загрязнения клеток крови. Промыть пупочную вену после canulating это с одной стороны стерильный шприц 5 мл оснащен тупой конец стрелки с PBS, пока жидкость выходит другой конец шнура становится полностью прозрачным (красноватый указывает крови загрязнения).

ECFCs:

4. Подготовка 75 см ² колбы (Corning), пометьте его и заполнить в 15-20 мл подогретого EGM-2 среды.
5. Место шнура в новой пластинкой заполнена стерильной PBS.
   
   Возьмите хирургические ножницы и перерезал пуповину на две части около 5 см в длину (короткие куски легче обрабатывать, потому что пупочных сосудов скручены вокруг своей оси).
6. Попробуйте найти пупочную вену (большой сосуд), вставьте одно лезвие вашего хирургических ножниц и вырезать вены продольно. На данный момент это может быть полезно, если помощник может держать уже сократила вены с двумя щипцами в то время как вы режете дальше.
7. Место шнур пирогсе с разрезом вены в новой пластинкой без PBS, возьмите скребок клетки и очистить от внутренней (эндотелия) поверхности пупочной вены на срисовывать с одного конца до другого. Передача клеткам вашего подготовлены колбу путем очистки кончик скребок в среде. Повторите эту процедуру, по крайней мере 10 раз.
8. Закройте флакон и положил его в инкубатор (37 ° C, 5% СО _2, 95% влажности).

МСК:

4. Подготовка 150 см ² пластины культуры (Corning) и назовите его.
5. Возьмите кусок шнура (после соскабливания эндотелиальных слой) и сократить весь шнур на очень мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц и стерильным скальпелем. Максимальный размер шнура части должны быть на 1-2 мм.
6. Передавайте свои части шнур с стерильных щипцов в ваш предварительно помечены культуры пластины. Оставляя открытым пластине в течение 5 минут до заполнения со средой, крепление частей к пластиковой поверхности усиливается.
7. Как только шнур части соединены надлежащим образом пластмассы, аккуратно добавить в 30-35 мл подогретого альфа изменение MEM. Попробуйте использовать низкие скорости, чтобы убедиться, что все фигуры остаются прикрепленными.
8. Закройте пластины и поместить его в инкубатор (37 ° C, 5% СО _2, 95% влажности).

Часть 3: расширение сотовых и подтверждение иммунной фенотипа с помощью проточной цитометрии

Сотовые расширения

EFCFs:

1. Проверьте крепления эндотелиальных клеток на следующий день на инвертированный микроскоп и обмен целом EGM-2 средних, чтобы избавиться от всех не прилагается клеток и частиц.
2. Развернуть клетки до слияния и обмена треть среду дважды в неделю. Когда слияние будет достигнуто, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества клеток в вашем T75 колбу, вы должны выбрать размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
3. Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.

МСК:

1. Следствием МСК из пуповины займет больше времени, так что вы можете ждать не менее 3-4 дней, пока вы проверить на инвертированный микроскоп для появления веретенообразных клеток в окрестностях прилагается частей ткани. При наличии достаточных ячейки вне роста, фигуры, как правило, отделить, потому что они теряют контакт с пластиком.
2. Через 10-12 дней удалить ткань куски, отделить МСК из пластика с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и передавать их на новые суда культуры. В зависимости от количества ячеек в вашей тарелке вы должны решить, размер и количество новых колбы, чтобы гарантировать низкую плотность посева для дальнейшего расширения.
3. Биржа треть среду два раза в неделю во время расширения клеток.

Проточная цитометрия

Необходимое оборудование:

Проточный цитометр (BD FACSCalibur), micronic труб (Corning), держателя трубки, овец сыворотке (блокирующий реагент), Eppifuge (Eppendorf), моноклональные антитела
МСК: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, изотип управления
ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, изотип управления

1. Дойдя до слияния, отделить клетки с 0,05% Trypsin/0.7 мМ ЭДТА и центрифуге при 300 в течение 7 мин при 4 ° C.
2. Ресуспендируют клетки концентрации 1х10 ^{6 клеток} / мл в PBS и модифицированный блок неспецифических антител обязательным с 10% об. / овец сыворотки в течение 20 мин при 4 ° C.
3. Этикетка micronic труб и добавить соответствующие концентрации люминесцентных меченых антител.
4. Добавить 50 мкл клеточной суспензии (заблокирован) в каждую пробирку и инкубировать 30 мин при 4 ° C.
5. Вымойте клетки, добавив изменение PBS для удаления необязательных антител.
6. Идите с вашей помечены ячейки проточного цитометра и выполнения анализа.

Часть 4: ECFC роста колоний, фиксация, окрашивание и анализа иерархий

1. Семенной практически чистый собрано ECFCs при очень низкой плотности покрытия из 3 или 10 клеток на квадратный сантиметр в виде пластин клеточных культур, чтобы обеспечить единый роста колонии.
2. Биржа треть среду дважды в неделю.
3. После 14 дней (конец культуры) удалить среды, мыть два раза PBS и исправить колонии с ледяной решение фиксации (ацетон: Метанол = 3: 2) в течение 15 минут в холодильник.
4. Отменить фиксацию решение и оставить открытыми пластинами высохнуть в течение 10 минут.
5. Увлажняет клетки с дистиллированной воде в течение 10 минут.
6. Добавить Харрис гематоксилин решения и пятно фиксированной колонии в течение 12 минут.
7. Удалить H matoxylin раствора и промыть пластины с водопроводной водой, чтобы избавиться от оставшихся окрашивание раствора.
8. Возьмите фотографии каждой колониииспользованием стереомикроскопа и импорт *. JPG или *. TIF формата файлов на вашем компьютере.
9. Откройте фотографию с помощью программного обеспечения ImageJ и анализировать точный номер мобильного каждой колонии, как описано в анимации.
10. Открытое программное обеспечение ImageJ и импорта колонии изображение с помощью "Файл \ Открыть" функцию в выпадающем меню.
11. Приступить с помощью "Процесс \ вычитание фона» функции
12. Используйте функцию '* * эллиптические или кистью отбора "в меню ImageJ отметить колонии маржи.
13. Очистить окружающих образ с помощью "Правка \ Очистить Вне 'функции и обрезания изображения, выбрав пункт" Изображение \ урожая.
14. Отрегулируйте порог вручную с помощью "Изображение \ Настройка \ Threshold 'функцию, таким образом, что все клетки полностью окрашены в красный цвет.
15. Граф количества клеток в колонии, выбрав "Проанализировать \ Анализ частиц». Выберите соответствующие настройки (оптимизированы для каждого типа клеток) и выберите "OK". Результаты окно, в том числе клеток и новый образ, содержащий соответствующие очертания рассчитывал клетки появится.
    

Обсуждение

Существует множество источников, из которых, чтобы получить МСК или ECFCs в том числе костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови и т.д.

Необходимо, чтобы получить оба типа прародителей из того же источника напрямую сравнивать участия различных типов клеток в процессах...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
alpha modified MEM	Sigma-Aldrich
L-GLutamin	Sigma-Aldrich
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich
EBM	Lonza Inc.
Single cytokine quots	Lonza Inc.
75 cm2 flasks	Corning
150 cm2 plates	Corning
Cell scraper	Corning
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich
Monoclonal antibodies	BD Biosciences
PBS
50 ml tubes	Falcon BD
500 mL filter 20 μm pore size	EMD Millipore
Preservative free heparin	Biochrom AG