Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Résumé

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Résumé

Le cordon ombilical est une source riche pour les cellules progénitrices avec un potentiel prolifératif élevé, y compris les cellules stromales mésenchymateuses (appelé aussi les cellules souches mésenchymateuses, cellules souches mésenchymateuses) et des cellules endothéliales progénitrices formant colonie (CPEF). Les deux types de cellules sont des acteurs clés dans le maintien de l'intégrité des tissus et sont probablement également impliqués dans les processus de régénération et de la formation de tumeurs.

Pour étudier leur biologie et leur fonction de manière comparative, il est important d'avoir les deux types de cellules disponibles à partir du même donneur. Il peut également être bénéfique à des fins de régénération pour dériver MSC et CPEF du même tissu.

Parce thérapies cellulaires devrait finalement trouver leur chemin à partir du laboratoire au chevet, nous avons établi une nouvelle méthode pour isoler et d'élargir les cellules progénitrices sans l'utilisation de protéines animales. Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) a remplacé le sérum fœtal bovin dans toutes les étapes de notre protocole d'éviter complètement de contact des cellules aux protéines xénogéniques.

Cette vidéo montre une méthode pour l'isolement et l'expansion des cellules souches d'un cordon ombilical.

Tous les matériaux et les procédures seront décrites.

Protocole

Partie 1: Mise en place

1. Préparation du milieu de culture cellulaire

Avant de commencer la préparation moyennes rassembler tous les matériaux et les outils dont vous aurez besoin.
Dégel 2 x 56 ml de mise en commun des aliquotes lysat plaquettaire humain (pHPL, self-made: la référence 1 & JoVE # 1523), 10 ml d'une pénicilline 100x / solution de streptomycine, 2 x 5 ml de L-glutamine (Sigma fois).

Décongeler les cytokines et les aliquotes facteur de croissance vasculaire (VEGF, bFGF, l'EGF, l'IGF, l'hydrocortisone, l'acide ascorbique, l'héparine, à condition que l'amphotéricine 'quots unique ») ajusté pour compléter 1 bouteille (500 ml) de l'AGE-2 moyennes (Lonza).

Du réfrigérateur prendre une bouteille de 500 ml chacune des (i) l'alpha-modifiés milieu essentiel minimal (MEM a-) et (ii) moyenne endothéliales basale (EBM).

Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus dans des conditions stériles.

Préparer l'héparine sans conservateur (par exemple, Biochrom) en dissolvant la poudre à une concentration finale de 1000 UI / mL avec de l'eau stérile.

MSC-Medium:

Utiliser 500 mL d'une MEM-, ajoutez 56 ml d'décongelés pHPL (voir aussi la référence 1 pour plus de détails) et 2 UI / ml (= 224 pi de solution de stock) de l'héparine sans conservateur (évite la coagulation du milieu par l'agglutination des le fibrinogène dans le plasma) pour atteindre une concentration finale de 10% pHPL. De plus ajoutez la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100μg/mL) solution et 2mM de L-glutamine (Sigma fois).

Filtrer le support grâce à un 20-um des pores du filtre à vide de taille (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date).

ECFC-Medium:

Utilisez une bouteille (500 ml) de l'EBM, ajouter les parties aliquotes de cytokine, 56 ml de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl de solution mère) de l'héparine sans conservateur, la pénicilline (100U/mL) / streptomycine (100 g / ml) de solution et 2mm de la L-glutamine au milieu de base et le filtre avec un 20 ul-pores sous vide taille du filtre (Millipore). Étiquette de la bouteille de façon appropriée (contenu, date).

2. Stérilisation des instruments chirurgicaux

Pince, paire de ciseaux chirurgicaux et détenteur de bistouri doit être la chaleur de minerai jetables stérilisés stérile.

3. Préparation des tubes de collecte de cordon

Ajouter 500 UI de conservateur - sans héparine à 50 tubes en polypropylène ml (Falcon) et ajuster à un volume final de 20 ml avec du PBS. Transférer les tubes dans la salle d'accouchement.

4. Le consentement éclairé (confirmé par votre comité d'éthique local ou IRB).

Demandez aux parents avant la livraison s'ils souhaitent faire don d'un morceau de la corde et de les informer adéquatement sur les fins il servira.

5. Don de moelle

Après la livraison et l'inspection du placenta et le cordon coupé un morceau de 10 cm et immédiatement le transférer sur votre tube de pré-remplie avec de l'héparine pour éviter la coagulation du sang restant à l'intérieur des vaisseaux du cordon. Continuer sur l'isolement cellulaire dès que possible.

Partie 2: Isolement cellulaire

1. Préparer un écoulement laminaire de culture de tissus capuche en nettoyant les surfaces avec Incidin ou 70% EtOH. Placez stériles de 150 cm ² plaques de culture cellulaire, 75 flacons de culture cellulaire cm (deux Corning), PBS, des instruments chirurgicaux stérilisés, grattoirs cellulaire, porte-tube, 25 ml et stripettes seringues de 5 ml muni d'aiguilles extrémité émoussée appropriée dans votre hotte nettoyé.
2. Pré-chauffer votre prêt α-MEM et EGM-2 milieu de culture cellulaire à 37 ° C dans un bain d'eau.
3. Porter le cordon d'alimentation de la salle d'accouchement à votre laboratoire équipé de la hotte de culture cellulaire. Après le transfert du cordon dans l'écoulement laminaire le laver deux fois dans du PBS (en transférant à une nouvelle plaque) pour se débarrasser de contaminer les cellules sanguines. Rincer la veine ombilicale après canulating sur un côté avec une seringue stérile de 5 ml équipée d'une aiguille extrémité émoussée avec PBS jusqu'à ce que le fluide sortant de l'autre bout de la corde devient complètement transparente (rougeâtre indique une contamination du sang).

CPEF:

4. Préparer un flacon de ⁷⁵ cm2 (Corning), l'étiqueter et remplissez 15-20 ml de pré-chauffé EGM-2 moyennes.
5. Placer le cordon dans une assiette remplie de nouvelles PBS stérile.
   
   Prenez les ciseaux chirurgicaux et couper le cordon ombilical en deux morceaux d'environ 5 cm de longueur (courtes pièces sont plus faciles à traiter, parce que les vaisseaux ombilicaux sont tordus sur leur axe).
6. Essayez de trouver la veine ombilicale (grand récipient), insérer une lame de votre ciseaux chirurgicaux et couper la veine longitudinalement. À ce point il pourrait être utile si un assistant peut tenir la veine déjà réduit par deux pinces pendant que vous découpez supplémentaires.
7. Placer la tarte cordonCE avec la veine coupée dans une nouvelle plaque sans PBS, prendre le grattoir à cellules et gratter de l'intérieur (endothélium) de surface de la veine ombilicale par frottages d'un bout à l'autre. Transférer les cellules de votre flacon préparé par le nettoyage de la pointe de la raclette dans le milieu. Répétez cette procédure au moins 10 fois.
8. Fermez votre flacon et le mettre dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO _2, 95% d'humidité).

MSC:

4. Préparer une plaque de 150 cm ² de culture (Corning) et l'étiquette.
5. Prenez le morceau de cordon (après grattage de la couche endothéliale) et couper le cordon tout en très petits morceaux en utilisant des ciseaux stériles et scalpel stérile. La taille maximale des pièces cordon devrait être de 1-2 mm.
6. Transférez vos morceaux cordon avec la pince stérile dans votre assiette de la culture pré-étiquetés. En laissant ouverte la plaque pendant 5 minutes avant de remplir avec le milieu, l'attachement des pièces à la surface du plastique est renforcée.
7. Une fois les morceaux de cordon sont connectés de façon appropriée à la matière plastique, ajouter doucement dans les 30 à 35 ml de la pré-alpha réchauffé modifiés MEM. Essayez d'utiliser la vitesse la plus basse pour être sûr que tous les morceaux restent attachés.
8. Refermez la plaque et le mettre dans un incubateur (37 ° C, 5% de CO _2, 95% d'humidité).

Partie 3: l'expansion des cellules immunitaires et la confirmation de phénotype par cytométrie en flux

L'expansion des cellules

EFCFs:

1. Vérifier la fixation des cellules endothéliales, le lendemain sur un microscope inversé et d'échanger ensemble EGM-2 moyennes pour se débarrasser de toutes les cellules non-inscrits et les particules.
2. Développer les cellules jusqu'à confluence et l'échange d'un tiers des moyennes deux fois par semaine. Lorsque la confluence est atteinte, détacher les cellules avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d'EDTA et de les transférer à des navires nouvelle culture. Selon le nombre de cellules dans votre flacon T75, vous devez choisir la taille et le nombre de vos nouveaux flacons pour garantir la densité de semis faible pour poursuivre son expansion.
3. Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine pendant l'expansion des cellules.

MSC:

1. L'excroissance de cellules souches mésenchymateuses de la moelle prendra plus de temps, vous pouvez donc attendre au moins 3-4 jours jusqu'à ce que vous vérifiez sur un microscope inversé à l'apparition de cellules fusiformes dans les environs des morceaux de tissu attaché. Quand il ya suffisamment de cellules hors de croissance, les morceaux ont tendance à se détacher, car ils perdent le contact avec le plastique.
2. Après 10-12 jours enlever les morceaux de tissu, détachez les MSC de la matière plastique avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d'EDTA et de les transférer à des navires nouvelle culture. Selon la quantité de cellules dans votre assiette, vous devez décider de la taille et le nombre de vos nouveaux flacons pour garantir la densité de semis faible pour poursuivre son expansion.
3. Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine pendant l'expansion des cellules.

La cytométrie en flux

Équipement nécessaire:

Cytomètre en flux (BD FACSCalibur), microniques tubes (Corning), porte-tube, moutons sérum (réactif de blocage), Eppifuge (Eppendorf), les anticorps monoclonaux
MSC: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, les contrôles isotype
CPEF: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, les contrôles isotype

1. Après avoir atteint la confluence, détachez la cellule avec 0,05% Trypsin/0.7 mM d'EDTA et centrifuger à 300g pendant 7 min à 4 ° C.
2. Resuspendre les cellules à une concentration de 1x10 ⁶ cellules / ml dans PBS modifiés et contraignant bloc d'anticorps non spécifiques avec 10% v / v de sérum de moutons pendant 20 min à 4 ° C.
3. Etiqueter les tubes microniques et ajouter la concentration appropriée de fluorescence des anticorps marqués.
4. Ajouter 50 ul de suspension cellulaire (bloqué) à chaque tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
5. Laver les cellules modifiées par l'ajout du PBS pour éliminer les anticorps non contraignant.
6. Allez avec votre cellulaire étiquetés pour le cytomètre de flux et d'effectuer l'analyse.

Partie 4: ECFC croissance de la colonie, la fixation, coloration et analyse la hiérarchie

1. Graines du CPEF pratiquement pure récoltés à densité de placage très faible de 3 ou 10 cellules par centimètre carré de plaques de culture cellulaire pour permettre la croissance seule colonie.
2. Bourse un tiers de la moyenne deux fois par semaine.
3. Après 14 jours (fin de la culture) éliminer le milieu, se laver deux fois avec du PBS et fixer les colonies avec une solution de fixation de la glace froide (acétone: méthanol = 3: 2) pendant 15 minutes au réfrigérateur.
4. Jeter la solution de fixation et de laisser les plaques ouvert à sécher pendant 10 minutes.
5. Réhydrater les cellules avec de l'eau distillée pendant 10 minutes.
6. Ajouter Harris solution d'hématoxyline et tacher les colonies fixes pendant 12 minutes.
7. Retirer H matoxylin solution et rincer les plaques avec de l'eau du robinet pour se débarrasser de la solution de coloration restant.
8. Prenez des photos de chaque colonie par desl'aide d'un stéréomicroscope et d'importation *. jpg ou *. tif fichiers sur votre ordinateur.
9. Ouvrez les photos avec le logiciel ImageJ et d'analyser le nombre de cellules précises de chaque colonie comme décrit dans l'animation.
10. Ouvrez le logiciel ImageJ et importer une image de colonies en utilisant le menu «Fichier \ Ouvrir" fonction dans le menu déroulant.
11. Procédez en utilisant le «Processus \ Contexte Soustraire« fonction
12. Utilisez la fonction «sélection * * elliptiques ou une brosse» dans le menu de ImageJ pour marquer la marge colonie.
13. Effacer l'image environnante à l'aide "Modifier \ extérieur Clear 'fonction et recadrer l'image en sélectionnant« Crop Image \'.
14. Ajustez le seuil manuellement en utilisant le "Image \ Réglage Seuil \ 'fonction, de sorte que toutes les cellules sont complètement colorés en rouge.
15. Comptez le nombre de cellules de la colonie en sélectionnant «Analyser \ analyser des particules». Choisissez les paramètres appropriés (optimisé pour chaque type de cellule) et sélectionnez «OK». La boîte de résultats, y compris le nombre de cellules et une nouvelle image contenant les grandes lignes correspondantes des cellules compté apparaîtra.
    

Discussion

Il ya une variété de sources à partir duquel obtenir MSCS ou CPEF notamment la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang de cordon, etc

Il est nécessaire d'obtenir deux types de progéniteurs de la même source de comparer directement l'implication des différents types de cellules dans des procédés tels tissus et la régénération des navires ou de contribution à la progression tumorale.

La facilité avec laquelle d'isoler et d'étudier l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
alpha modified MEM	Sigma-Aldrich
L-GLutamin	Sigma-Aldrich
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich
EBM	Lonza Inc.
Single cytokine quots	Lonza Inc.
75 cm2 flasks	Corning
150 cm2 plates	Corning
Cell scraper	Corning
Trypsin/EDTA	Sigma-Aldrich
Monoclonal antibodies	BD Biosciences
PBS
50 ml tubes	Falcon BD
500 mL filter 20 μm pore size	EMD Millipore
Preservative free heparin	Biochrom AG