Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

Резюме

Здесь описывается процедура осуществляется в мембранных Кэффри Структурно-функциональная биологии Группа настроить вручную кристаллизации испытания мембранных белков в липидных мезофаз.

Аннотация

Подробный протокол для кристаллизации мембранных белков с помощью липидных мезофаз описано. Этот метод имеет разному упоминается как липидный кубической фазе или в методе мезо. Метод был показан довольно универсальны в том, что она была использована для решения рентгеноструктурный структуры прокариотических и эукариотических белков, белки, которые являются мономерные, гомо-и гетеро-мультимерные, хромофор-содержащих и хромофора-свободной, и альфа- -спиральных и бета-баррель белков. Недавние успехи в использовании кристаллизации мезо являются человеческой инженерии бета2-адренорецепторов и аденозин A2a G-белком рецепторы. Протоколы представляются для восстановления мембранного белка в моноолеина основе мезофазы, а также для создания кристаллизации в ручном режиме. Дополнительные шаги в рамках общего процесса, такие, как кристалл уборки, должны быть рассмотрены в следующих статьях видео. Время, необходимое для подготовки белка загружены мезофазы и создать кристаллизации пластины вручную составляет около одного часа.

протокол

Важным направлением в области структурных и функциональных биология биологические мембраны (рис. 1). Мембрана, которая окружает клетки и субклеточных органелл, когда он присутствует, молекулярно тонкой структуры только две молекулы липидного поперек и усеяна белки. Структура и функции применительно к обоим липидов и белков, представляющих интерес. Тем не менее, тема этой статьи ограничен мембранных белков.

Лучше понять, как мембранные белки функции на молекулярном уровне ищется по двум причинам. Во-первых, интеллектуальное удовлетворение, зная, как они работают. Во-вторых, зная, как белка работы, всегда есть перспектива быть в состоянии исправить это должно неисправности или улучшения или даже модифицировать его для конкретных приложений. Наркотиками дизайн очевидным результат этого вида работ. Один из подходов к вычислять как мембранный белок работает на молекулярном уровне, чтобы определить его структуру. Это предполагает установление места в 3-мерном пространстве всех атомов, или, по крайней мере, все без атомов водорода, которые составляют белки. Метод мы используем для этой цели макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). На рисунке 2 показан пример мембранный белок, структура которого определяется с использованием MX. Кристаллов дифракционных качество белка требуется сделать MX.

Очевидно, Есть много этапов определения структуры использования кристаллографии макромолекул. Это показано на рисунке 3. Как правило, эти включают в себя определение целевой мембранный белок, а затем производства, очистки и кристаллизации его. Дифракционные измерения проводятся на кристалл использования дома или синхротронного рентгеновского источника. Дифракционные данные обрабатываются уступая карту электронной плотности, которая затем устанавливается с молекулярной модели. Модели, когда изысканный, могут быть использованы для изучения механизма действия белка и для структуры разработки на основе препарата.

В центре внимания данной статьи является показать, как мы производим дифракции качество кристаллов мембранных белков на липидный мезофазы, по так называемым методом в мезо. Недавний обзор метода и область ее применения, содержится в источнике 1 (Кэффри, 2009). Шаг за шагом протокола мы будем следовать здесь описывается в ссылке 2 (Кэффри и Черезов, 2009).

Блок-схема кратко этапы и время, необходимое для установки в мезо мембраны суда кристаллизации белков показано на рисунке 4. В данной статье рассматриваются эти шаги заключены в красной пунктирной линии.

Часть 1: Подготовка Кристаллизация Плиты

1. Позиция silanized слайд микроскоп на верстаке.
2. Снимите защитную крышку бумаги от одной поверхности полосы перфорированные ленты двойной Spacer палку (в продаже, см. таблицу специфических реактивов и оборудования ниже).
3. Место ленты, липкой стороной вниз, при контакте с поверхностью слайда.
4. Давление уплотнения ленты слайд с помощью осел или валиком. Алюминиевая фольга может быть помещен между лентой и роликом для защиты базы скважин.
5. Удалите вторую крышку бумаги из ленты подвергать его верхней липкой поверхностью.
6. Место отдельных silanized покровных в непосредственной близости от пластины для быстрой и эффективной герметизации скважины, как только загрузка будет завершена.

Часть 2: Подготовка липидов Шприц

1. Место липидов (часто моноолеина) в контролируемой температурой блока при 45 ° С в течение 3 минут, чтобы сделать ее расплавленным.
2. Хотя липидного тает подготовить два 100-мкл газонепроницаемые Гамильтон шприцы для использования в липид-белковых стадии смешения. Удалить тефлоновым наконечником из шприца, который будет содержать белок решение. Место шприца, который будет содержать липидные рядом с ним (оставляя его наконечник на месте).
3. Подключите переходник (см. таблицу специфических реактивов и оборудования ниже, и Ссылка 3 (Cheng и соавт., 1998)) в липидных шприц. Finger затянуть переходник для шприца, но не затягивайте. Удалите поршень из ствола липидного шприц.
4. Обратите внимание, что липидные должна быть расплавленной прежде чем продолжить. Установить пипетки на 30 мкл и медленно занимают примерно 30 мкл расплавленного липидов. Медленно доставить как можно больше расплавленной липидной, как вы можете в открытый конец шприца осторожно, чтобы не ввести воздушные зазоры.
5. Место поршень в ствол в контакте с расплавленным липидов и медленно продвигаться плунжера бочку с шприц в вертикальном положении, как показано в видео. Пузырьки воздуха, которые могут попасть случайно должен вырасти в этом процессе и быть освобожден.
6. Тщательно определения объема липидов в шприц, прочитав маркировку на шприц баррель.
7. Слайд FERRULE на иглу простирается от муфты. Используйте поршень, чтобы заставить расплавленной липидной до ствола и медленно и осторожно в иглу в центре муфты.

Часть 3: Подготовка белка Шприц

1. Раствора белка должна вращаться при 14000 г в течение 5 до 10 минут при температуре 4 ° С для удаления крупных агрегатов до создания кристаллизации испытаний. Удалить раствора белка из льда и дать ему уравновешивания при комнатной температуре.
2. Рассчитайте объем раствора белка использовать для формирования кубической фазы на уровне или близко к полной гидратации. Для моноолеина при 20 ° С, полной гидратации с водой происходит при близких к 40% воды (по массе), как в диаграмме ⁵ (рис. 5).
3. С 25 или 50 мкл шприце Hamilton занять необходимый объем раствора белка. Перенесите раствор на кончик тефлон из поршень в стволе белка шприц избегая пузырьков воздуха.
4. Аккуратно извлеките иглу и измеряют объем белкового раствора в шприце. Она должна соответствовать значению поставлен в предыдущем шаге.
5. Медленно дюймовый раствора белка до баррель в конечном итоге на одном уровне с его открытый конец.
6. Винт белка шприца в открытый конец муфты придается липидного шприц. Очень важно, чтобы устройство не быть чрезмерно затягивается. За затягивание собраны смесительного устройства на данном этапе может привести к повреждению наконечники и вызвать течь. Заместитель ужесточение также приведет к утечке.

Часть 4: Смешивание раствора белка и липидов: Создание мезофазы

1. Чтобы эффект смешивания, заранее поршень на белок стороне собранный смеситель до предела, с большим или указательным пальцем вождения раствора белка из белка шприц, через переходник и в липидных шприц.
2. Поршень на липидный сторона в настоящее время используется для управления содержанием липидного шприц обратно через переходник и в белок шприц.
3. Процесс повторяется много раз, иногда, сто мест и более, необходимых для производства однородной мезофазы. В начале перемешивания, движения материальных и обратно через ответвитель может быть неравномерным и, порой, дополнительную силу необходимо, чтобы эффект смешивания. Первоначальные смешивания обычно сопровождается развитием неоднородных облачности в образце. Как гомогенизации прогрессирует, текстура становится более равномерным и характеристики вязкого кубической фазы, как и внешний вид новых кубических мезофазы.
4. Если условия будут уместны и кубические формы фазы, дисперсии должно появиться оптически прозрачный в шприце баррель. Таким образом, маркировка на шприца должен быть четким через мезофазы в бочке.
5. Очень небольшое охлаждение образца во время смешивания, помещая шприц смесителя в течение короткого времени на льду может ускорить унификацию и достижение прозрачности. Тем не менее, важно не переохлаждаться образца.
6. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать чрезвычайно интенсивное перемешивание, так как это может привести к температуре образца расти в связи с фрикционного нагрева ^3.

Часть 5: Загрузка диспенсер

1. Удалите иглу и поршень из 10-мкл шприца Гамильтона. Оставьте тефлоновым наконечником на месте.
2. Снимите гайку из колонки с помощью небольшой монеты.
3. С храповым рука полностью выведены, вставьте шприц - без его поршень и игла - через проведение кольцо распылителя.
4. Заменить гайку, прокладка стороной шприц, и закрепите его в плотно на открытый конец шприца.
   Следует проявлять осторожность, чтобы обеспечить шприца правильно с центром в проведении кольцо и что ствол выравнивается параллельно храповиком руку. Как можно судить на глаз. Эти два требования являются критическими, чтобы избежать утечки.
5. Пропустите через поршень захвата кольцо с захватом гайку отвинтить несколько оборотов и направлять поршень в открытый конец шприца. Нажмите храповиком руки в полном объеме. Переместите поршень в ствол и убедитесь, что он проходит свободно и справедливо баррель. Это может помочь ослабить винт на шины для облегчения поршень движется свободно. Убедитесь, что он делает. Нажмите на поршень, пока его тефлоновым наконечником совпадет с нуля мкл знак окончания на баррель. Если винт на бар руководство было ослаблены, затяните его и перепроверить, что поршень движется свободно.
6. Перемещение плунжера на одной стороне собран смеситель с нуля мкл знак окончания передачи мезофазы с другой шприц и муфты.
7. Отсоедините пустой шприц (с наконечником на месте) от смесительного агрегата и сразу же подключить загружены шприц - с ответвительttached - на резьбовые окончания 10-мкл шприца дозатора. Степень герметичности, с которой осуществляется связь имеет решающее значение, как уже отмечалось.
8. Нагрузка дозирования шприц, нажав на поршень 100-мкл шприц так, чтобы мезофазы переводы через переходник.
9. Безопасные короткие, телевизор с плоским наконечником иглы стали прекращение шприц для дозирования и тщательно закрепите его на месте.
10. Зажим поршень для трещотки руку, затянув гайки в захватывающий кольцо. Следует проявлять осторожность, чтобы не затягивайте гайки, так как это может забить и деформировать поршень, что делает его непригодным для использования. Важно, что диапазон перемещения предоставлена ​​храповиком руке зажат в условиях ограничиваться не более чем на дюйм, как показано в видео. Помимо этого, поршень будет иметь тенденцию к пряжке и доставка может потерпеть неудачу.
11. Нажмите храповиком барабан несколько раз, чтобы заранее поршень в цилиндре, тем самым заполняя свободном объеме иглы и загрузка иглы. Этот шаг следует повторять (до десяти раз), пока непрерывная цепь мезофазы выходит из кончика иглы.
12. Кристаллизация испытания должны начаться немедленно, так как некоторые белки являются неустойчивыми в кубической фазе без добавления осадителя.

Часть 6: Настройка Кристаллизация Плиты

1. Место мульти-луночного планшета кристаллизации и покровное на поверхность подняты на несколько сантиметров выше верстак для удобства погрузки. Оптимальный контраст и улучшения видимости достигаются тогда, когда поверхность немного темнее.
2. Однородный осадителя решения и открывать флаконы. Установить осадителя пипетки дозирования до 1 мкл.
3. С шприц дозирования в вертикальном положении в одной руке, использовать свободную руку в положение иглы в центре, а непосредственно над основанием и номером 1. Нажмите кнопку на повторяющиеся диспенсер изгнать болюс мезофазы на поверхности стекла. Болюсного объем 200 нл, когда стандартные повторяющиеся диспенсер используется с 10-мкл шприц. Кончике иглы должна быть не более нескольких сотен микрометров над основанием и для обеспечения надлежащей доставки.
4. После 4-х соседних скважин загружаются с мезофазы, 1 место мкл осадителя решения друг на мезофазы болюсного использованием 2-мкл пипетки и стандартные одноразовые наконечники.
5. Как можно скорее, место покровное прямо над заполнены скважин, чтобы покрыть их равномерно. Для осуществления водонепроницаемое уплотнение, используйте лопаточку, чтобы оказать давление на покровное, где он вступает в контакт с обнаженной липкой поверхности прослойки ленты.
6. Мезофазы и осадителя процесс выдачи может быть повторен, пока все скважины на пластине будут загружены и опечатаны.
7. Этикетка пластины четко для отслеживания. Светочувствительный белков, как правило, обрабатываются упаковки пластин в алюминиевую фольгу перед помещением их в инкубационной камере.
8. Место пластин в контролируемой температурой камеры, как правило, при 20 ° C.
9. На регулярной, осмотрите скважин для роста кристаллов использованием поляризованной световой микроскоп с 10 или 20-кратное цели. График, используемые в лаборатории автора заключается в следующем: 0 дней, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 и 60 после установки. Внимательно осмотрите мезофазы болюсного настройки глубины резкости в пределах 0,14-мм образца. Экспертиза должна осуществляться как в обычном свете и между скрещенными-поляризаторов.

Часть 7: Представитель Результаты

Появление в результате кристаллы будут меняться в зависимости от присущих цвет мембранный белок, поляризация света, используемого для проверки (или их отсутствие), а также способ и качество освещения. На рисунке 6 показано несколько возможных выступлений кристалла. Естественно цветные мембранных белков, растущих в мезо, если смотреть с нормальным свет может выглядеть так, как показано на рисунке 6 (панели б, г). Бесцветный мембранных белковых кристаллов, растущих в кубической фазе, если смотреть с нормальным свет может выглядеть так, как показано на рисунке 6 (группа E). Наконец, бесцветный мембранный белок, кристаллы растут в мезо, если смотреть с поляризованным светом может выглядеть как на рисунке 6 (панели и с).

Следующие шаги в общий процесс определения структуры являются для сбора и крио-прохладный кристаллов и для записи и анализа дифракции рентгеновских лучей от них. Эти темы должны быть охвачены в отдельных статьях Юпитер.

Рисунок 1. Схематическое изображение биологической мембраны показывает липидного бислоя в и на которых расположены разнообразные белки.

Рисунок 2. Структураиз витамина B ₁₂ транспортировки белков, BtuB, решается с помощью MX и кристаллов, выращенных по методу в ^мезо-6, приведенных в этом Юпитер статьи.

Рисунок 3. Структурно-функциональных цикл иллюстрирует многие шаги, связанные с получением и использованием полную структурную информацию о белке.

Рисунок 4. Блок-схема обобщает этапы производства кристаллов белка мембраны в методе мезо. Только эти шаги окруженные красной пунктирной линии были рассмотрены в этой статье Юпитер. С Ссылка 2.

Рисунок 5. Упрощенной температура-состав фазовой диаграммы для липидов (моноолеина) / водной системы. Кристаллизация испытаний создаются при 20 ° С, где липидного насыщения водой на 40% гидратации. Подробная схема фазы в источнике 5.

Рисунок 6. Кристаллы мембранных белков, растущих в липидной мезофазы.
() Витамина В ₁₂ транспортировки белков, BtuB ^6, (б) светособирающего комплекса II ^7, (в) адгезина / invasin OPCA ^8, (г) бактериородопсина ^9, (е) углеводов транспортер из Pseudomonas. Изображения, записанные с обычным светом (б, г, д), а также между скрещенными поляризаторами (а, с).

Обсуждение

Кубической фазы является деликатной и динамичной среде, которая может существенно меняться с изменением числа переменных. Это не возможно, чтобы дать описание настройки в мезо кристаллизации испытания в ручном режиме, описывающий все возможные ловушки. Тем не менее, многие трудности можно избежать, практикуя техники перед нанесением его на дорогостоящие решения белок и с помощью умеренность в давление на шприцы в процессе перемешивания. Совершено правильно, в методе мезо может дать кристаллы различных белков, количество которых постоянно растет.

Описание здесь настройки в испытаниях мезо кристаллизации ориентирован на ручной режим. Процесс может быть, и часто изменяется, чтобы облегчить автоматизированные установки кристаллизации пластин в тех случаях, когда требуется крупномасштабное обследование условий кристаллизации.

Материалы