Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Riepilogo

Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Abstract

Un protocollo dettagliato per cristallizzare proteine ​​di membrana utilizzando mesophases lipidico è descritto. Questo metodo è stato variamente definito la fase lipidica cubi o nel metodo meso. Il metodo ha dimostrato di essere molto versatile in quanto è stato utilizzato per risolvere i raggi X delle strutture cristallografiche di proteine ​​procarioti ed eucarioti, proteine ​​che sono monomeriche, omo-ed etero-multimerica, cromoforo contenenti e cromoforo-free, e alfa elica e beta-barile proteine. Recenti successi utilizzando in cristallizzazione meso sono progettati umano beta2-adrenergici e adenosina A2a G recettori accoppiati alla proteina. I protocolli sono presentati per la ricostituzione della proteina di membrana in monoolein basato mesofase, e per la creazione di cristallizzazioni in modalità manuale. Ulteriori passi nel processo globale, come la raccolta di cristallo, sono da affrontare in articoli futuro video. Il tempo necessario per preparare la proteina-caricato mesofase e di istituire un piatto cristallizzazione manualmente è di circa un'ora.

Protocollo

Un focus importante nel campo della biologia strutturale e funzionale è la membrana biologica (Figura 1). La membrana che avvolge il cellulare e subcellulare organelli quando presente, è una struttura molecolare sottile appena due molecole lipidiche tutta ed è costellata di proteine. Struttura e funzione applicata ad entrambi lipidi e le proteine ​​sono di interesse. Tuttavia, il focus di questo articolo è limitato alle proteine ​​di membrana.

Una migliore comprensione di come le proteine ​​di membrana funzione a livello molecolare è richiesta per due motivi. In primo luogo, vi è la soddisfazione intellettuale nel sapere come funzionano. In secondo luogo, sapendo come una proteina funziona, c'è sempre la prospettiva di essere in grado di risolvere il problema dovesse funzionare male o di migliorare o addirittura modificarlo per applicazioni particolari. Progettazione di farmaci è un risultato evidente di questo tipo di lavoro. Un approccio per capire come una proteina di membrana lavora a livello molecolare è quello di determinare la sua struttura. Si tratta di stabilire la posizione in 3-dimensionale spazio di tutti gli atomi, o almeno non tutti gli atomi di idrogeno, che costituiscono le proteine. Il metodo che usiamo a questo scopo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). La Figura 2 mostra un esempio di una proteina di membrana la cui struttura è stata determinata utilizzando MX. Un cristallo di qualità diffrazione della proteina è necessario per MX.

Chiaramente, ci sono molti passi coinvolti nella determinazione della struttura con la cristallografia macromolecolare. Questo è illustrato in Figura 3. In genere, questi includono l'identificazione di un obiettivo proteina di membrana, e quindi la produzione, purificazione e cristallizzazione esso. Misure di diffrazione vengono eseguiti sul cristallo con una casa o una raggi X di sincrotrone fonte. I dati di diffrazione sono trattati producendo una mappa di densità elettronica che è poi dotato di un modello molecolare. Il modello, se raffinato, può essere utilizzato per esplorare il meccanismo d'azione delle proteine ​​e per la struttura a base di progettazione di farmaci.

Il focus di questo articolo è quello di mostrare come si produce cristalli di diffrazione di qualità delle proteine ​​di membrana con mesophases lipidico, con il cosiddetto metodo in meso. Una recente revisione del metodo e la sua portata è disponibile nella Guida di riferimento 1 (Caffrey, 2009). Il passo-passo protocollo seguiremo qui è descritto nella Guida di riferimento 2 (Caffrey e Cherezov, 2009).

Un diagramma di flusso che riassume i passi necessari e il tempo necessario per l'impostazione di un processo di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana meso è mostrata in Figura 4. Questo articolo riguarda quei passi racchiusa da linee tratteggiate rosse.

Parte 1: Preparazione del Piastre cristallizzazione

1. Posizionare un vetrino da microscopio silanizzata sul banco di lavoro.
2. Togliere il coperchio di protezione di carta da una superficie di una striscia di nastro perforato doppio bastone distanziatore (disponibile in commercio, vedi Tabella di reagenti e attrezzature specifiche di seguito).
3. Posizionare il, lato adesivo del nastro verso il basso, a contatto con la superficie del vetrino.
4. Pressione di tenuta del nastro alla diapositiva utilizzando un Brayer o un rullo. Foglio di alluminio può essere collocato tra il nastro e il rullo per proteggere la base dei pozzi.
5. Togliere il coperchio seconda carta dal nastro per esporre la sua superficie superiore appiccicosa.
6. Luogo coprioggetto singoli silanizzata in prossimità della piastra di sigillatura veloce ed efficiente dei pozzi non appena il caricamento è completo.

Parte 2: Preparazione della siringa Lipid

1. Posizionare il lipidi (spesso monoolein) in un blocco a temperatura controllata a 45 ° C per 3 minuti per renderlo fuso.
2. Mentre il lipidica si sta sciogliendo preparare due da 100 microlitri tenuta di gas siringhe Hamilton per l'uso in lipidi-proteina fase di miscelazione. Rimuovere la ghiera in teflon dalla siringa che conterrà la soluzione proteica. Posizionare la siringa che conterrà i lipidi accanto ad esso (lasciando la ghiera in posizione).
3. Collegare l'accoppiatore (vedi Tabella di reagenti e attrezzature specifiche di riferimento sotto e 3 (Cheng et al., 1998)) alla siringa lipidico. Serrare a mano l'accoppiatore alla siringa, ma non stringere eccessivamente. Togliere lo stantuffo dal corpo della siringa lipidi.
4. Si noti che i lipidi devono essere fuse prima di procedere. Impostare la pipetta a 30 microlitri e lentamente occupano circa 30 ml di lipidi fuso. Lentamente fornire la maggior quantità di lipidi fuso, come si può in parte aperta della siringa avendo cura di non introdurre traferri.
5. Posizionare il pistone nel cilindro a contatto con il fuso lipidi e lentamente avanzare il pistone il cilindro con la siringa in posizione verticale, come dimostrato nel video. Bolle d'aria che potrebbero essere intrappolati inavvertitamente dovrebbe aumentare nel processo ed essere rilasciato.
6. Con attenzione determinare il volume di lipidi nella siringa leggendo i segni sul corpo della siringa.
7. Far scorrere il FerrULE l'ago si estende dal accoppiatore. Usa lo stantuffo per spingere la lipidico fuso il barile e lentamente e delicatamente l'ago nel centro del giunto.

Parte 3: Preparazione della siringa Proteine

1. La soluzione di proteine ​​deve essere filata a 14.000 g per 5 a 10 minuti a 4 ° C per rimuovere grandi aggregati prima di impostare processi di cristallizzazione. Rimuovere la soluzione proteica dal ghiaccio e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente.
2. Calcolare il volume di soluzione proteica da utilizzare per formare la fase cubica in corrispondenza o nei pressi di idratazione completa. Per monoolein a 20 ° C, idratazione completa con acqua si verifica in% di acqua vicino a 40 (in massa), come nel diagramma di fase ⁵ (Figura 5).
3. Con una siringa da 25 o 50 microlitri Hamilton prendere il volume richiesto di soluzione proteica. Trasferire la soluzione sulla punta in Teflon del pistone nel cilindro della siringa proteina avendo cura di evitare bolle d'aria.
4. Attentamente l'ago e misurare il volume di soluzione proteica nella siringa. Deve corrispondere al valore fornito nel passaggio precedente.
5. Lentamente pollici la soluzione proteica il barile per finire a filo con la sua estremità aperta.
6. Avvitare la siringa proteina nella estremità aperta del accoppiatore attaccato alla siringa lipidico. E 'fondamentale che il dispositivo non essere eccessivamente serrati. Un serraggio eccessivo del dispositivo assemblato di miscelazione in questa fase potrebbe danneggiare le boccole e causare perdite. Under serraggio porterà anche a perdite.

Parte 4: Soluzione proteica e lipidica: Rendere il mesofase

1. Per effetto di miscelazione, far avanzare il pistone sul lato proteina dell'unità montata mescolando al suo limite, con il pollice o l'indice guida la soluzione proteica fuori la siringa proteina, attraverso l'accoppiatore e nella siringa lipidi.
2. Il pistone nella parte lipidica è ora utilizzato per guidare il contenuto della siringa lipidico indietro attraverso l'accoppiatore e nella siringa proteine.
3. Il processo è ripetuto molte volte, occasionalmente, un centinaio di passaggi o più sono necessari per produrre un mesofase omogeneo. All'inizio di miscelazione, il movimento di materiale avanti e indietro attraverso l'accoppiatore può essere irregolare e, a volte, la forza supplementare è necessario per effettuare la miscelazione. Miscelazione iniziale è di solito accompagnata dallo sviluppo di una non uniforme nuvolosità nel campione. Come omogeneizzazione progredisce, il tessuto diventa più uniforme e caratteristico della fase viscoso cubi, così come l'aspetto visivo del mesofase emergenti cubi.
4. Se le condizioni siano appropriati e le forme cubiche fase, la dispersione dovrebbe apparire otticamente trasparenti nel corpo della siringa. Così, i segni sul corpo della siringa deve essere chiaramente leggibili attraverso l'mesofase nella canna.
5. Raffreddamento molto lieve del campione durante la miscelazione mettendo il mixer siringa per un breve periodo su ghiaccio può accelerare l'omogeneizzazione e la realizzazione di trasparenza. Tuttavia, è importante non eccessivamente il campione.
6. Si deve prestare attenzione per evitare estremamente vigorosa miscelazione, in quanto ciò può causare temperatura del campione a salire a causa del riscaldamento attrito ^3.

Parte 5: Caricamento del Dispenser

1. Rimuovere l'ago e il pistone da un 10-microlitri siringa Hamilton. Lasciare la ghiera in teflon in posizione.
2. Rimuovere il dado di fissaggio dal distributore con l'ausilio di una piccola moneta.
3. Con il braccio cricchetto completamente ritirato, inserire la siringa - senza il suo stantuffo e ago - attraverso l'anello di sostegno del distributore.
4. Sostituire il dado, guarnizione laterale di fronte alla siringa, e avvitarla saldamente sull'estremità aperta della siringa.
   Si deve prestare attenzione per assicurare la siringa sia correttamente centrata sul ring holding e che la canna è allineato parallelamente al braccio cricchetto. Entrambi possono essere giudicati da occhi. Questi due requisiti sono fondamentali per evitare perdite.
5. Passare il pistone attraverso l'anello presa con il dado pinza svitato qualche giro e guida il pistone nella parte aperta della siringa. Premere il braccio cricchetto completamente. Muovere il pistone nel cilindro e controllare che viaggia liberamente e vero nella canna. Può essere utile per allentare la vite sulla barra di guida per facilitare lo stantuffo muoversi liberamente. Assicurarsi che lo fa. Spingere il pistone fino a quando la sua punta in teflon si allinea con la tacca di zero laurea microlitri sulla canna. Se la vite sulla barra di guida è stata allentata, lo stringere e ricontrollare che il pistone si muove liberamente.
6. Spostare lo stantuffo su un lato l'unità montata mescolando al segno zero, laurea microlitri di trasferire la mesofase per l'altra siringa e l'accoppiatore.
7. Staccare la siringa vuota (con la sua ghiera in posizione) dal gruppo di miscelazione e immediatamente collegare la siringa carica - con l'accoppiatore unottached - per la cessazione filettato della siringa da 10 microlitri di erogazione. Il grado di tenuta con la quale viene fatto accoppiamento è fondamentale, come già notato.
8. Caricare la siringa erogazione premendo lo stantuffo della siringa da 100 microlitri in modo che i trasferimenti mesofase attraverso l'accoppiatore.
9. Fissare un breve, a punta piatta ago per la cessazione d'acciaio della siringa di erogazione e con attenzione stringere in posizione.
10. Bloccare il pistone al braccio cricchetto serrando il dado sul ring presa. Si deve prestare attenzione a non stringere troppo il dado, in quanto questo può segnare e deformare il pistone rendendolo inutilizzabile. E 'importante che la gamma di viaggi forniti al braccio cricchetto nella condizione bloccata essere limitato a non più di un pollice, come dimostrato nel video. Oltre a questo, il pistone avrà una tendenza a fibbia e la consegna può fallire.
11. Premere il tamburo cricchetto più volte per far avanzare il pistone nel cilindro, in modo da riempire il volume vuoto l'ago e il caricamento l'ago. Questa operazione deve essere ripetuta (fino a dieci volte) fino a una serie continua di mesofase emerge dalla punta dell'ago.
12. Processi di cristallizzazione deve iniziare subito, come alcune proteine ​​sono instabili in fase di cubi senza precipitante aggiunto.

Parte 6: Impostazione Piastre cristallizzazione

1. Posizionare un multi-pozzetti cristallizzazione e coprioggetto su un piano rialzato a pochi centimetri sopra il banco di lavoro per la facilità di carico. Contrasto ottimale e una maggiore visibilità si ottengono quando la superficie è leggermente scuro.
2. Omogeneizzare la soluzione precipitante e stappare le fiale. Impostare la pipetta precipitante erogazione a 1 microlitri.
3. Con la siringa di dosaggio in posizione verticale in una mano, usare la mano libera per posizionare la punta dell'ago al centro e direttamente sopra la base del numero di ben 1. Premere il pulsante sul dispenser ripetizione di espellere un bolo di mesofase sulla superficie del vetro. Il volume del bolo è di 200 nL quando l'erogatore standard di ripetizione viene utilizzato con una siringa da 10 microlitri. La punta dell'ago deve essere non più di qualche centinaio di micrometri di sopra della base del pozzetto per garantire la corretta consegna.
4. Dopo 4 pozzi adiacenti sono caricati con mesofase, metti 1 ml di soluzione precipitante in cima ad ogni bolo mesofase con un 2-microlitri pipetta e standard puntali monouso.
5. Il più rapidamente possibile, mettere un coprioggetto esattamente sopra i pozzi pieni di coprire in modo uniforme. Per effettuare un sigillo a tenuta d'acqua, utilizzare una spatola per applicare la pressione al coprioggetto dove fa contatto con la superficie esposta appiccicoso del nastro distanziatore.
6. Il mesofase e precipitante processo di erogazione può essere ripetuta fino a quando tutti i pozzetti sulla piastra vengono caricati e sigillati.
7. Etichetta la piastra in modo chiaro per scopi di monitoraggio. Sensibile alla luce le proteine ​​sono di solito gestiti da avvolgendo le piastre in alluminio prima di metterli nella camera di incubazione.
8. Posizionare le piastre in una camera a temperatura controllata, di solito a 20 ° C.
9. Su un programma normale, ispezionare i pozzetti per la crescita dei cristalli utilizzando un microscopio a luce polarizzata con un obiettivo di 10 o 20 volte. Il programma utilizzato nel laboratorio dell'autore è la seguente: giorno 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 e 60 di post-installazione. Ispezionare con cura il bolo mesofase regolazione della profondità di campo all'interno del campione 0,14 mm di spessore. L'esame dovrebbe essere fatto sia alla luce normale e tra incrociate polarizzatori.

Parte 7: Risultati Rappresentante

L'aspetto dei cristalli risultante varia con il colore intrinseco della proteina di membrana, la polarizzazione della luce utilizzate per l'ispezione (o mancanza) e il metodo e la qualità dell'illuminazione. La figura 6 mostra diverse apparizioni in cristallo possibile. Proteine ​​di membrana naturalmente colorato crescendo in meso se visti con la luce normale può apparire come quelli mostrati in figura 6 (pannelli b e d). Cristalli incolori proteina di membrana in crescita nella fase cubi se visti con la luce normale può apparire come quelli mostrati in figura 6 (Pannello di e). Infine, cristalli incolori proteina di membrana crescendo in meso se vista con luce polarizzata può apparire come figura 6 (pannelli A e C).

Le prossime fasi del processo generale di determinazione della struttura sono a raccolta e crio-raffreddare i cristalli e di registrare ed analizzare diffrazione ai raggi X da loro. Questi argomenti sono a carico JOVE in articoli separati.

Figura 1. Rappresentazione schematica di una membrana biologica che mostra il doppio strato lipidico e sulla quale si trovano una varietà di proteine.

Figura 2. La strutturadella vitamina B ₁₂ trasportare proteine, BtuB, risolto con MX e cristalli cresciuti dal metodo in meso ⁶ illustrato in questo articolo Giove.

Figura 3. La struttura-funzione del ciclo illustra molti dei passi necessari per ottenere e utilizzare informazioni complete su una proteina strutturale.

Figura 4. Il diagramma riassume le fasi coinvolte nella produzione di cristalli di proteina di membrana dal meso nel metodo. Solo quei passi circondato dalla linea tratteggiata rossa sono trattati in questo articolo Giove. Dal riferimento 2.

Figura 5. Semplificata temperatura-composizione per il diagramma di fase lipidica (monoolein) / sistema idrico. Processi di cristallizzazione sono impostati a 20 ° C dove la lipidico satura con acqua a 40% l'idratazione. Il diagramma di fase dettagliato è disponibile nella Guida di riferimento 5.

Figura 6. Cristalli di proteine ​​di membrana crescita nel mesofase lipidico.
(A), vitamina B ₁₂ proteine ​​di trasporto, BtuB ^6, (b) che raccolgono la luce complesso II ^7, (c) la adesina / invasin OPCA ^8, (d) batteriorodopsina ^9, (e) un trasportatore di carboidrati da Pseudomonas. Le immagini registrate con la luce normale (b, d, e) e tra polarizzatori incrociati (a, c).

Discussione

La fase di cubo è un ambiente delicato e dinamico che può cambiare drasticamente con l'alterazione di una serie di variabili. Non è possibile dare una descrizione del setup di cristallizzazione negli studi meso in modalità manuale che descrive tutti i potenziali insidie. Tuttavia, molte difficoltà possono essere evitate praticando la tecnica prima di applicarlo a costose soluzioni di proteine ​​e usando moderazione della pressione applicata al siringhe durante la miscelazione. Fatto correttamente, il metodo in meso può produrre cristalli di una grande varietà di proteine, il cui numero è in costante aumento.

La descrizione data qui della configurazione nei processi di cristallizzazione meso è incentrata sulla modalità manuale. Il processo può essere, e spesso viene modificato per facilitare l'installazione automatica delle piastre di cristallizzazione in quei casi che richiedono uno screening su larga scala delle condizioni di cristallizzazione.

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