Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

Резюме

Гибкий и эффективный метод для характеристики типа клеток конкретных локализации белка и nucleocytoplasmic челночные описывается. Этот подход использует heterokaryon флуоресцентно меченных белков слияния в локализации изображения белка после слияния клеток. Протокол поддается стационарных локализации или более динамических определений основаны на реальных изображений клеток.

Аннотация

Значительное количество белков регулируется субклеточных людьми или nucleocytolasmic челночные. Эти белки отображения разнообразных клеточных функций в том числе ядерного импорта / экспорта РНК и белка, регуляции транскрипции и апоптоза. Интересно, что основные сотовые реорганизаций в том числе деление клеток, дифференциации и трансформации, часто связаны с такой деятельностью ^3,4,8,10. Детальное изучение этих белков и их соответствующих регулирующих механизмов может быть сложным, как стимуляция этих локализация изменений может быть реализована, а движения сами по себе могут быть весьма динамичной и трудно отследить. Исследования с участием сотовой онкогенеза, например, продолжают пользоваться понимания путей и белка деятельности, которые отличаются между нормальным первичных элементов и трансформированных клеток ^6,7,11,12. Как и многие белки-шоу изменило локализации в процессе трансформации, или в результате преобразования, методы эффективно охарактеризовать эти белки и пути в которых они участвуют стенд для улучшения понимания онкогенеза и открытия новых областей доставка лекарственных препаратов.

Здесь мы представляем метод анализа белков торговли людьми и челночные деятельности между первичным и преобразована клетках млекопитающих. Этот метод объединяет поколения heterokaryon слияния с флуоресцентной микроскопии обеспечить гибкий протокол, который может быть использован для обнаружения стационарного или динамической локализации белка. Как показано на рисунке 1, два отдельных типов клеток, которые временно трансфекции плазмидой конструкций подшипников fluoroprotein ген придает гена. После выражения, клетки сливаются с использованием полиэтиленгликоля и белка локализаций затем могут быть отображены с помощью различных методов. Протокол, представленные здесь, фундаментальный подход к которым специализированные методики могут быть добавлены.

протокол

1. Трансфекции клеточных линий

Трансфекция Способ 1

(Lonza Nucleofection для повышения эффективности первичной трансфекции клеток)

1. Клетки должны быть последнего прохода и в логарифмической фазе роста до трансфекции. Вымойте клеток в phophate солевом буфере (PBS) и урожай клеток трипсинизации.
2. Сбор клетки центрифугированием при 1500 мкг в течение 5 минут.
3. Добавить стерилизовать скользит корки до 6-луночный планшет. Покровные стекла могут быть покрыты для улучшения адгезии клеток. Место 1,5 мл питательной среды (в данном случае средний Дульбеко изменение Орла (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)) в каждую лунку и равновесие СМИ в инкубаторе.
4. Урожай клеток трипсинизации и ресуспендируют в минимальном объеме фосфатным буферным раствором (PBS).
5. Граф клеток и центрифуги правильное количество ресуспендирования обеспечить ~ 5x10 ^{5 клеток} на пробу.
6. Ресуспендируют клетки тщательно в 100 мкл комнатной температуре Nucleofector раствора на образце.
7. Комбинат по 100 мкл клеточной суспензии с 5 мкг плазмидной ДНК и передачи образца Nucleofector кювет стараясь не включают воздушные пузыри.
8. Выберите соответствующий Nucleofector программы (для этого может потребоваться предыдущего тестирования установить оптимальную эффективность трансфекции с минимальными смертность).
9. Вставьте кювету клеток / ДНК суспензии в Nucleofector Держатель кювет и начать выбранной программы.
10. После завершения удаления кюветы и добавить ~ 500 мкл предварительно уравновешенную питательных сред на него (взяты из 6-луночный планшет).
11. Сразу передачи образца в 6-луночный планшет с конечного объема 1,5 мл на лунку. Клетки должны быть покрыты либо смешанным населением или по отдельности, для элементов управления.

Трансфекция Способ 2

(Qiagen Effectene трансфекции для клеточных линий)

1. Подготовка трансфекции комплексов с использованием реагентов Qiagen Effectene добавьте сначала 0,8 мкг каждого образца ДНК плазмиды до 200 мкл буфера ЕС.
2. Добавить 6,4 мкл реагента усилитель для каждого образца, смешать кратко, щелкая трубки, и инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
3. Добавьте 20 мкл Effectene реагент для каждого образца, перемешать, щелкая трубки и инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
4. Во время этой инкубации подготовить двух клеточных линий, представляющих интерес для трансфекции. Вымойте недавно пассировать клетки (<80% слияния) один раз в фосфатным буферным раствором (PBS). Плюс 1,5 мл свежей нагревается и уравновешенной ростовой среды (в данном случае Дульбеко изменение Орла среды (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)).
5. После трансфекции комплексы инкубируют в течение 15 минут, передача 1,2 мл средств массовой информации для каждого образца. Смешать с помощью пипетки, и немедленно передать ~ 700 мкл комплексов для каждой из двух скважин в 6-луночный планшет. Добавить по каплям, и перемешать, осторожно, вращая тарелку. Разрешить клетки для трансфекции, по крайней мере за 3 часа (может меняться в зависимости от типа клеток).
6. Добавить стерилизовать скользит корки до новой 6-луночный планшет. Покровные стекла могут быть покрыты для улучшения адгезии клеток.
7. После трансфекции клетки, клетки мыть два раза PBS и урожай клеток минимальна trysinization, добавив примерно 100 мкл раствора трипсина в каждую лунку, кратко агитацию пластина полностью пальто каждую лунку и сразу аспирационных от трипсина. Как только клетки подняли, добавить 1,5 мл свежей информации.
8. На данный момент, камеры должны быть покрыты в любом смешанных или отдельных групп населения (для контроля) на стерильную скользит крышку.
9. Разрешить клетки для восстановления в течение 12 часов.

2. Сотовые Fusion

1. Удалить культуру средств массовой информации из клетки и мыть дважды с PBS.
2. На данный момент, рекомендуется для лечения клеток с циклогексимид (100 мкг / мл) для ингибирования синтеза белка. Разрешить клетки инкубировать в течение 2 часов и затем промыть клетки в два раза с PBS.
3. Предохранитель клетки, подвергая их решения 50% полиэтиленгликоля 1000 (ПЭГ 1000) в бессывороточной DMEM за 125 секунд при комнатной температуре.
4. Вымойте клеток с PBS, чтобы удалить раствор PEG 1000, и добавьте 2 мл свежей нагревается и уравновешенных средств массовой информации.
5. Разрешить клетки инкубировать в течение 18 - 24 часов.

Флуоресцентной микроскопии

1. Удалить культуру средств массовой информации, и промыть клетки дважды в PBS.
2. Fix клетки, добавляя 1 мл 4% параформальдегида решения (в PBS) в каждую лунку. Аккуратно агитировать за 15 минут.
3. Вымойте фиксированной клетки дважды в PBS.
4. Аккуратно снимите крышку ускользает из пластины, фитиль лишнюю PBS. Обратить на предметные стекла загружаются с одной каплей монтажа средний (90% глицерина, 100 мм Трис рН 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo октановым числом), содержащий DAPI (4 ',6-diamidino-2-фенилиндола).
5. Удалите излишки монтажа среды из слайдов и печать сотрудничестваверсии скользит с лаком для ногтей.
6. Визуализация клеток с помощью конфокальной микроскопии или epifluorescence.

3. Представитель Результаты

На рисунке 2 показан пример heterokaryon эксперимент с использованием первичных фибробластов и H1299 немелкоклеточного клетки карциномы легких. Белок в данном эксперименте (Куриное анемия вирусов VP3) отображает в первую очередь цитоплазматической локализации в первичных типов клеток и ядерной локализации в трансформированных клеточных типов, как визуализируется epifluorescence микроскопии. Белка выражается в слиянии либо GFP (pEGFP-N1 вектор, Clontech) в первичных фибробластов крайней плоти (PFF) или DsRed (DsRed-N1 вектор, Clontech) в H1299 клеток. Контрольные образцы с участием самостоятельно слияния (два верхних строк) дисплей многоядерные клетки, не изменяя при стационарных моделей локализации. Такие изменения в противном случае может произойти из-за чувствительности к слиянию условий или образование syncitia. Heterokaryon слияния (нижний ряд) демонстрируют ядерную вступления GFP-плавленого первичная ячейка происхождения белка и колокализации с DsRed, слившихся белков в ответ на введение трансформированной клетки материала. Пример, показанный является относительно редким heterokaryon слияние в результате только две клетки, один из каждого типа, о чем свидетельствует присутствие обоих fluoroprotein сигналов. В дополнение к выявлению этих типов локализации переходы, nucleocytoplasmic челночные деятельность может быть легко обнаружены наличие одного флуорофора в обоих ядер. Этот тип определения ясно при рассмотрении 1:01 слияния клеток и будет зависеть от ингибированием трансляции.

Рисунок 1. Блок-схема heterokaryon метод с использованием первичных фибробластов и H1299 немелкоклеточным раком клетки. Интересующего гена клонируется производить в рамке слияние с одним из двух флуоресцентных генов белка. Клеточные линии, затем кратковременно трансфицированных либо построить и позволил восстановить. Heterokaryon формирования индуцированных краткое лечение полиэтиленгликоля (ПЭГ), а затем дальнейшей инкубации. Наконец, субклеточные локализации белка интереса наблюдается с использованием различных форм флуоресцентного микроскопа.

Рисунок 2. Nucleocytoplasmic торговли людьми и челночные активность вируса куриного белка Анемия VP3 визуализированы путем слияния heterokaryon. Верхний ряд: Представитель изображения собственного плавленого H1299 клеток, экспрессирующих DsRed-VP3 Ближний ряд:.. Представитель epifluorescence образы первичных клеток фибробластов крайней плоти (PFF), выражающая GFP-VP3 после слияния PEG Нижний ряд: Heterokaryon слияние PFF и H1299 клеток. Желтый указывает колокализации GFP и DsRed сигналов. Клетки были обследованы использовании Leica AF6000E флуоресцентного микроскопа Leica и обработки изображений.

Обсуждение

Протокол heterokaryon представленные здесь обеспечивает эффективное и легко интерпретируемых методом для характеристики типа клеток конкретных локализации поведения, а также nucleocytoplasmic челночные деятельности. Этот метод использует чувствительности флуоресцентного анализа, а также способность изображения живых клеток и выполняют исследования динамики белков. Техника легко адаптируется для различных типов клеток и может принять как жить и фиксированной ячейки изображения. Например, перевернутый флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для живого изображения и промежуток времени захвата видео. В отличие от этого, установлены клетки могут быть использованы в любом epifluorescence микроскопии для определения стационарной локализации или более подробные конфокальной микроскопии дискретных локализаций. Более того, такие методы, как флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP), или флуоресценции потери фотообесцвечивания (FLIP) может быть использована при определении локализации кинетики ^1. Включение альтернативного флуорофоров в протокол позволит взаимодействия белка экспериментов, таких как флуоресценции передачи энергии резонанса (FRET), которые будут проводиться в концертном ^2. Различные ингибиторы клеточного торговли, такие как B leptomycin или доминирующего отрицательного Ran GTPase конструкции могут быть использованы для установления зависимости от конкретного импорта или экспорта пути ^5,6,9.

• В некоторых экспериментах с челночные деятельности, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать локализации эффектов, связанных с синтезом новых белков. В этих случаях перевод ингибиторы или ограниченные моменты времени должны быть использованы. Тем не менее, артефакты из-за поступательное торможение остается возможность. Сотовые слияния с одной из каждого типа клеток являются самыми желанными для четкое толкование челночные и локализации поведения. Оптимизация количества клеток и синтеза условий (времени и концентрации), могут быть необходимы для содействия таких благоприятных слияние 1:01 событий.
• Важно отметить, что оптимизация определенные шаги в протоколе будет необходимо в зависимости от конкретного типа используемой базовой станции. Аспекты в экспериментальной процедуры, такие как слияние эффективности, эффективность трансфекции, и жизнеспособность после слияния могут значительно различаться между типами клеток. В частности, первичные типы клеток, может оказаться непростой задачей для управления из-за сложных условий культуры и низкой эффективности трансфекции. Использование таких технологий, как устройства Lonza Nucleofector может позволить для быстрой обработки клеток, а также значительно повысить эффективность трансфекции. Кроме того, электропорации методы позволяют легко переносить клеток в суспензии до слияния следующих шагах.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Effectene reagent	Qiagen	301425
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P5493
Trypsin	Fisher Scientific	SH3023602
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	SH30243FS	High glucose
paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Hyclone Serum (fetal bovine)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3008803HI
Falcon 6-well plates	Fisher Scientific	08-772-1B
Polyethylene glycol 1000	Fisher Scientific	528875-25GM
Cover slips	Fisher Scientific	12-545-85
DABCO	Sigma-Aldrich	D2522-25G
Nucleofector HDF kit	Lonza Inc.	VPD-1001