Протокол обнаружения и очистки газовой фазе Свободные радикалы в дыме сигарет

Резюме

Спин-захвата ЭПР-спектроскопии был использован для изучения влияния растительных антиоксидантов ликопин, Пикногенол и экстракт косточек винограда на очистку газовой фазе свободных радикалов в сигаретном дыме.

Аннотация

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking ^5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens^9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung³. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke⁴. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke¹⁴. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine⁸. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy^1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively^11,13

протокол

1. Материалы

Все растворители, используемые в этой работе были реагента класса. Спиновых ловушек, в том числе N-трет-бутил-α-phenylnitrone (PBN) и стандартный ярлык спина 2,2,6,6-тетраметил-1-piperinyoxyl (TEMPO) были получены от Sigma и были использованы при поставке. Завод антиоксидантов были получены коммерчески от Свонсон, Inc США.

2. Подготовка сигаретного дыма и анализ свободных радикалов

1. Внести антиоксидантов в фильтр, Пикногенол антиоксиданты и экстракт виноградных косточек были сначала растворяют в 95% этанола, в то время как ликопин растворяется в ацетоне. Растворитель объемы были различными в зависимости от антиоксидант растворимости.
2. Количество антиоксидантов в 0,4 мг / фильтр был использован. Затем они были покрыты 10 мг активированного угля. Для этой цели активированный уголь перемешивали в течение ~ 12 часов с антиоксидантными решения в анаэробных условиях, фильтруют и высушивают в вакууме.
3. Антиоксиданты были затем введены в обычных фильтра ацетат (CA фильтр). Для этого фильтр был разрезан на две части. Покрытием завода антиоксидантов были вставлены между двумя кусками фильтра, оборачивают кусок ленты для формирования фильтра - антиоксидант-фильтр сэндвич (рис. 1А). Этот комбинированный фильтр был впоследствии прилагается к сигарете стержни, содержащие табак. Фильтр контроля было сделано тем же способом, как антиоксидант, кроме фильтра не был добавлен антиоксидант.
4. До курения моделирования, исследования сигареты будут распакованы и хранится в постоянной влажности окружающей среды (20 ° C, относительная влажность 60%) с помощью насыщенного раствора NaBr в течение минимум 2 дня.
5. Курение моделирования для рутинного анализа проводился при комнатной температуре, используя один порт устройства для курения, которое, как показано на рис.1, состоит из аспиратора воды или GAST DOA-P104-BN вакуумный насос / компрессор (Бентон-Харбор, Мичиган), связанные спин-захватасборки через Т-образного перекрестка с одного конца открытым. Пуфы проводились путем подключения открытый конец которой оставался открытым между затяжками. Газа было проверено расходомер и установлена ​​на уровне ~ 2,2 SCFH = 17,5 мл / с, регулируя клапан расположен между насосом и вентиляционное отверстие.
6. Исследования сигареты копченой при условии слоеного объеме 35 мл на протяжении 2 секунд каждые 60 секунд, аналогично ^1. Курение моделирования для количественной оценки газофазного свободных радикалов была выполнена в сочетании с системой захвата спин, как показано на рис. 1.
7. Десять интенсивной клубы (35 мл / слоеного) были взяты для каждой сигаретой. В газовой фазе свободных радикалов были собраны путем пропускания через MCS Кембридже фильтр площадку, а затем в раствор вводят спина захвата (0,05 М PBN в бензол, 2,0 мл).
8. После последней затяжки, пузырилась захвата решением был скорректирован до первоначального объема (2,0 мл) с тем же бензола. Аликвоту был переведен в ~ 250 мм, 3 мм ID стеклянную трубку запечатаны с одного конца.
9. Улавливания раствора венозная использованием замораживания-оттаивания насоса процедуры. Это было заморожено в жидком азоте и вакуум применяется. Тогда это было талых в атмосфере аргона, что позволяет ловушке пузырьков газа бежать, и замороженные снова. После этого цикл повторяется три раза, трубки запаянные в вакууме, а используется в дальнейших измерениях ЭПР. Этот шаг необходим, потому что кислород, который хорошо растворим в бензоле, расширяет линий ЭПР органических радикалов. Дезоксигенирования значительно улучшает отношение сигнал-шум.
10. X-Band спектрах ЭПР регистрировали на спектрометре Bruker EMX на частоте 9,34 ГГц при стандартных условиях. Спектрометр настройки, используемые в большинстве экспериментов были: центр поля 3312.5G, сканирование шириной 80G, амплитудной модуляции 0.5G, постоянной времени 82 мкс, время сканирования 40 сек.
11. Аддуктов спиновых ловушек являются относительно стабильными в условиях эксперимента, который в некоторых случаях REQuired 25 скоплений, которые, как правило взяла ~ 20 мин. Однако, после 12 часов интенсивность сигналов ЭПР в растворе бензола снизилась на ~ 5 раз.
12. Для количественной оценки концентрации захвата аддукт, его начальная первой производной спектра ЭПР была интегрирована. В результате поглощения спектра показывает широкий фон синглет, скорее всего, из-за сажи / смолы, содержащиеся в дыме.
    
    После вычитания этого фона отделен тройка захвата аддукт был интегрирован еще один раз (рис. 2).

3. Представитель Результаты

Большинство свободных радикалов в горящей сигаретой производства дыма (газовая фаза) являются мгновенными и нестабильной. Для того чтобы наблюдать эти радикалы техника спин ловушка работает. Она захватывает газофазных свободные радикалы, превращая их в спину аддукт которая является более стабильной и может быть обнаружен с помощью метода ЭПР (рис.1). В настоящем исследовании спин-ловушку раствора 0,05М PBN была использована для сбора дыма газовой фазе свободных радикалов, которые являются смесью кислорода и углерода в центре радикалов, которые трудно отделить ^15. В нашем случае, однако, наблюдается расщепление сверхтонкой константы _N = 13.7G и _H = 1.95G очень похожи на соответствующие значения для улавливания аддуктов алкоксил свободных радикалов (RO.) ^2, предполагая, что они являются основным продуктом. Мы показали, что слабые сигналы ЭПР и низкая воспроизводимость наблюдается в наших первоначальных измерений (рис. 2) из-за влаги в дыму потока. Чтобы решить эту проблему, мы добавили жидкого азота (LN2) ловушке между Кембридже фильтр и решение спин ловушку. Л. Н. ₂ ловушки удалить воду из MCS потока быстрого замораживания, и взял его на внутренней стенке стеклянной трубки. Это значительно улучшило сигналы ЭПР и позволило очень воспроизводимые результаты (рис. 3).

Количество захваченных свободные радикалы определяли с помощьюэталонного образца. Для контрольных образцов без антиоксидантов, типичные концентрации аддукта в бензоле оценкам путем сравнения его двойной интеграл спектр с двойной интеграл спектра для известной концентрацией TEMPO был 1,24 мкм (рис.2). Так как количество воздуха проходит через каждую сигарету во время курения составлял ~ 350 мл, это дает оценку концентрации свободных радикалов в газовой фазе MCS из ~ 7.1X10 ^-9 М, а общее число захваченных радикалов из газовой фазы целой сигареты ~ 1.5X10 ^15. Оценка общего количества свободных радикалов в дыму сигарет целом, в том числе и газа и твердых частиц фазы, составляет ~ 10 ¹⁶ свободных радикалов ^9.

Различные уровни очистки эффект растительных антиоксидантов на газовой фазы свободных радикалов в основной поток табачного дыма не наблюдалось. Их очистка ставки были представлены на рис. 4. Ликопин и экстракт косточек винограда показала самые высокие темпы в то время как низкийэ ставка наблюдалась Пикногенол (рис.4).

Рисунок 1. Диаграмма улучшенной конструкции моделирования курения для сбора газовой фазе свободных радикалов в дыме сигарет (МКС) с использованием спиновых ловушек. MCS было обращено на воду аспиратора через CA фильтр, то Кембридж фильтра (желтый фильтр) и пропускается через отделитель жидкости азотом для удаления H ₂ O. Газообразных продуктов, наконец, отправился в спину ловушку и пропускается через раствор ловушку спина. Завод антиоксидант был помещен между двумя частями обычных фильтров ацетат (расширенный в кружке), подключенных к сигарете, чтобы убрать мусор свободных радикалов в MCS.

Рисунок 2. Количественную оценку для захвата спин-аддуктов концентрации бензола требует вычитания широкий сигнал фон от первого интеграциил спектра. Сверхтонкого расщепления параметров спин-захвата аддукта являются _H = 1,95 G, _N = 13.7G.

Рисунок 3. Проходя через LN2 ловушку существенно улучшает качество сигнала ЭПР получил спин-захвата MCS.

Рисунок 4. Влияние природных антиоксидантов на концентрации свободных радикалов в MCS. Относительной интенсивности сигнала: контроль - 100%, Пикногенол - 55%, экстракт косточек винограда - 12%, ликопин - 10%.

Обсуждение

Надежная оценка влияния различных свободных радикалов в табачном дыме требует воспроизводимые методики количественного определения свободных радикалов. Ранее ^1, было показано, что малые объемы более высокой концентрации спиновых ловушек решения в неполярных растворителях наиболее эффективны на захват свободных радикалов от табачного дыма. Сигаретный дым всегда содержит водяной пар от сжигания органических соединений и остаточной влажности в табаком, который может оказаться в улавливания растворителя. Это примесью воды в ловушку решение спин PBN существенно уменьшает время жизни спина аддуктов захвата и интенсивности их сигналов ЭПР. Удаление этого влаги простым проходящего MCS через U-образной трубки, охлаждаемой жидким азотом значительно улучшить качество спектрах ЭПР в наших экспериментах, хотя некоторая доля газовой фазы радикалы могут быть также в ловушке на замороженной поверхности.

Использование тсвою технику мы сравнили относительную эффективность различных радикально-очистки природных соединений введены в сигаретных фильтров. Мы обнаружили, что ликопин и экстракт виноградных косточек сразу после включения в сигаретные фильтры способны собирать до 90% свободных радикалов, от MSC газовой фазы. Такая высокая мощность очистки ряды эти дешевые доступны природных соединений среди наиболее эффективных сообщили защитники свободных радикалов, как гемоглобин и shikonine ^8,14. Тем не менее, в наших экспериментах, сигаретные фильтры загружены изучал естественные антиоксиданты потерял заметная часть их очистки емкости после недели хранения при комнатной температуре. Решение этой проблемы может стимулировать будущие применения ликопин и экстракт косточек винограда в коммерческих сигаретные фильтры.