Ein Protokoll zur Erkennung und Scavenging Gas-Phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Zusammenfassung

Spin-Trapping-ESR-Spektroskopie wurde verwendet, um die Wirkung von pflanzlichen Antioxidantien Lycopin, Pycnogenol und Traubenkernextrakt auf Spülgas-Phase freien Radikale im Zigarettenrauch zu studieren.

Zusammenfassung

Zigarettenrauchen ist mit der menschlichen Krebsarten. Es wurde berichtet, dass die meisten der Todesfälle infolge von Lungenkrebs durch Zigarettenrauchen ^5,6,7,12 verursacht werden. Obwohl Tabak Teer und verwandten Produkten in der Partikelphase von Zigarettenrauch Hauptursachen für krebserzeugende und erbgutverändernde Krankheiten sind, enthält Zigarettenrauch erhebliche Mengen an freien Radikalen, die auch als eine wichtige Gruppe von Karzinogenen ^9,10 berücksichtigt. Freie Radikale greifen Zellbestandteile durch Schädigung Proteinstruktur, Lipide und DNA-Sequenzen und erhöhen die Risiken der Entwicklung verschiedener Krebsarten. Inhalative Radikale Addukte, dass viele der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von Tabakrauch in der Lunge ³ beitragen. Es wurden Studien durchgeführt, um freie Radikale im Zigarettenrauch zu reduzieren, um die Risiken der durch Tabakkonsum verursachten Schäden zu verringern. Es wurde berichtet, dass Hämoglobin und Häm-haltigen Verbindungen konnten teilweise abzufangen Stickoxid-, Blind-Oxidantien und krebserregende flüchtige Nitrosoverbindungen von Zigarettenrauch ^4. Ein "bio-filter 'bestand aus Hämoglobin und Aktivkohle wurde verwendet, um die freien Radikale abzufangen und zu entfernen bis zu 90% der freien Radikale aus dem Zigarettenrauch ^14. Doch aufgrund der Kosten-Ineffizienz, war es nicht erfolgreich vermarktet. Eine andere Studie zeigte eine gute Spülung Effizienz von Shikonin, eine Komponente der chinesischen Kräutermedizin ^8. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein Protokoll zur Einführung der gemeinsamen natürliches Antioxidans Extrakten in den Zigarettenfilter zum Abfangen Gasphase freie Radikale im Zigarettenrauch und Messung der abzufangen Wirkung auf Gasphase freie Radikale in den Mainstream-Zigarette zu rauchen (MCS) mit Spin-Trapping Elektronen-Spin-Resonanz (ESR)-Spektroskopie ^1,2,14. Wir zeigten eine hohe Bindungskapazität von Lycopin und Traubenkernextrakt, die ihre zukünftige Anwendung in Zigarettenfilter Punkt könnte. Ein wichtiger Vorteil dieser Vor-pective Aasfresser ist, dass sie in großen Mengen von Nebenprodukten der Tomaten-oder Wein-Industrie bzw. ^11,13 erhältlich

Protokoll

1. Materialien

Alle Lösungsmittel in dieser Arbeit verwendet wurden analysenrein. Der Spin-Trap, einschließlich N-tert-Butyl-α-phenylnitron (PBN) und die Standard-Spin-Label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) wurden von Sigma bezogen und verwendet wurden wie geliefert. Die Anlage Antioxidantien wurden kommerziell von Swanson, Inc. USA erhalten.

2. Vorbereitung von Zigarettenrauch und Analyse von freien Radikalen

1. Zur Einführung Antioxidantien in den Filter, wurden die Antioxidantien Pycnogenol und Traubenkernextrakt zunächst in 95% Ethanol gelöst, während Lycopin in Aceton gelöst wurde. Das Lösungsmittel Bände unterscheiden sich je nach Antioxidans Löslichkeit.
2. Die Menge der Antioxidantien von 0,4 mg / Filter verwendet wurde. Sie wurden dann mit 10 mg Aktivkohle beschichtet. Zu diesem Zweck Aktivkohle wurde für ~ 12 Std mit dem Antioxidans Lösung unter anaeroben Bedingungen, filtriert und getrocknet unter Vakuum gerührt.
3. Antioxidantien wurden dann in die herkömmlichen Acetat-Filter (CA-Filter) eingeführt. Zu diesem Zweck wurde der Filter in zwei Teile geschnitten. Die beschichteten Werk Antioxidantien wurden zwischen zwei Stücken des Filters und umwickelt es mit einem Stück Klebeband eingesetzt, um einen Filter zu bilden - Antioxidans-Filter-Sandwich (Abb. 1A). Dieser kombinierte Filter wurde anschließend Zigarettensträngen Tabak enthaltend befestigt. Die Steuerung der Filter in der gleichen Weise wie die antioxidative Filter außer kein Antioxidans gemacht wurde aufgenommen.
4. Vor dem Rauchen Simulation wurden die Forschungs-Zigaretten ausgepackt und in einer konstanten Luftfeuchtigkeit (20 ° C, 60% relative Feuchte) mit einer gesättigten NaBr-Lösung für ein Minimum von 2 Tagen.
5. Smoking-Simulation für die Routineanalytik bei Raumtemperatur wurde mit einem Single-Port-Gerät, das Rauchen, wie in Abb. 1 dargestellt, besteht aus einer Wasserstrahlpumpe oder GAST DOA-P104-BN Vakuumpumpe / Kompressor (Benton Harbor, Mich) verbunden der Spin-TrappingMontage durch eine T-Kreuzung mit einem Ende offen. Puffs wurden, indem Sie das offene Ende, das offen zwischen den Zügen blieb durchgeführt. Der Gasstrom wurde durch Durchflussmesser kontrolliert und eingestellt auf ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s durch Verstellen eines Ventils zwischen der Pumpe und der Entlüftung installiert.
6. Die Forschungs-Zigaretten wurden unter der Bedingung, puff Volumen von 35 ml für eine Dauer von 2 Sekunden geraucht wiederholt sich alle 60 Sekunden, ähnlich wie bei ^1. Smoking-Simulation für die quantitative Abschätzung der Gasphase freie Radikale wurde in Zusammenarbeit mit der Spin-Trapping-System wie in Abb. durchgeführt. 1.
7. Zehn intensive Puffs (35 ml / Hub) wurden für jede Zigarette genommen. Gas-Phase freien Radikalen wurden durch das Bestehen der MCS durch eine Cambridge Filter gesammelt und dann in die Spin Trapping-Lösung (0,05 M PBN in Benzol, 2,0 ml) eingeführt.
8. Nach dem letzten Zug, war das Blasen Überfüllungslösung wieder auf sein ursprüngliches Volumen (2,0 ml) mit der gleichen Benzol. Ein Aliquot wurde in einem ~ 25 übertragen0 mm lang, 3 mm ID Glasrohr an einem Ende verschlossen.
9. Die Trapping-Lösung wurde sauerstoffarmes mit einem Gefrier-Pump-Auftau-Prozedur. Es wurde unter flüssigem Stickstoff eingefroren und ein Vakuum angelegt. Dann war es unter Argon-Atmosphäre aufgetaut, so dass eingeschlossene Gasblasen zu entkommen, und wieder eingefroren. Nach diesem Zyklus dreimal wiederholt wurde, wurde das Rohr zugeschmolzen unter Vakuum und in weitere ESR-Messungen. Dieser Schritt ist erforderlich, da Sauerstoff, der gut löslich in Benzol, erweitert ESR-Linien von organischen Resten. Desoxygenierung dramatisch verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis.
10. X-Band ESR-Spektren wurden auf einem Bruker EMX-Spektrometer bei einer Frequenz von 9,34 GHz unter Standard-Bedingungen aufgezeichnet. Das Spektrometer-Einstellungen in den meisten Experimenten verwendet wurden: Center-Bereich 3312.5G, Scanbreite 80G, Modulationsamplitude 0.5G, Zeitkonstante 82 Mikrosekunden Zykluszeit 40 sec.
11. Der Spin-Trap-Addukte sind relativ stabil bei dem Experiment Bedingungen, die in einigen Fällen required 25-Ansammlungen, die in der Regel dauerte ca. 20 min. Doch nach 12 Stunden die Intensität der ESR-Signale in Benzol-Losung ging um einen Faktor von ~ 5.
12. Zur Quantifizierung der Konzentration des Trapping-Addukt, war seine anfängliche ersten Ableitung ESR-Spektrum integriert. Die daraus resultierende Absorptionsspektrum zeigt ein breites Singulett Hintergrund, wahrscheinlich aufgrund Ruß / Teer-Produkte in den Rauch enthalten sind.
    
    Nach Abzug von diesem Hintergrund getrennt Triplett des Trapping-Addukt wurde ein weiteres Mal (Abb. 2) integriert.

3. Repräsentative Ergebnisse

Die meisten der freien Radikale in brennende Zigarette produzierten Rauch (Gasphase) sind sofort und instabil. Um diese Reste zu beobachten Spin-Trap-Technik eingesetzt wird. Es fängt in der Gasphase freie Radikale durch die Umwandlung in ein Spin-Addukt, das stabiler ist und von ESR (Abb. 1) festgestellt werden. In der vorliegenden Studie, die Spin-Trap-Lösung von 0,05M PBN wurde verwendet, um Rauch Gasphase freie Radikale, die ein Gemisch aus Sauerstoff-und Kohlenstoff-zentrierte Radikale, die schwer zu ¹⁵ separate, sind zu sammeln. In unserem Fall ist aber die beobachteten Hyperfeinaufspaltung Konstanten a _N = 13.7G und _H = 1.95g sind sehr ähnlich zu den entsprechenden Werten für Trapping-Addukte von Alkoxyl freie Radikale (Ro.) ^2, was darauf hindeutet, dass sie das Hauptprodukt sind. Wir zeigten, dass schwache ESR-Signale und geringen Reproduzierbarkeit in unseren ersten Messungen beobachtet werden (Abb. 2) wurden aufgrund der Feuchtigkeit in den Rauch fließen. Um dieses Problem zu lösen, haben wir einen flüssigen Stickstoff (LN2) trap zwischen dem Cambridge-Filter und der Spin-Trap-Lösung. Die LN _2-Falle entfernt Wasser aus der MCS Flow durch schnelles Einfrieren und eroberte es auf der Innenwand der Glasröhre. Diese stark ESR-Signale verbessert und erlaubt für hoch reproduzierbare Ergebnisse (Abb. 3).

Die Menge der eingeschlossenen freien Radikalen wurde mit einemReferenzprobe. Für Kontrollproben ohne Antioxidantien, war die typische Addukt-Konzentration in Benzol durch Vergleich seiner Doppelintegral Spektrum mit einem Doppel-Integral-Spektrum für bekannte Konzentration des TEMPO schätzungsweise 1,24 pM (Abb.2). Da die Menge an Luft ging durch jede Zigarette beim Rauchen war ~ 350 ml, gibt dieser eine Schätzung für das freie Radikal-Konzentration in der Gasphase von MCS von ~ 7.1X10 ^-9 M und einer Gesamtzahl von Radikalen aus der Gasphase gefangen einer ganzen Zigarette ~ 1.5x10 ^15. Eine Schätzung für die gesamte Menge an freien Radikalen im Rauch einer Zigarette ganzen, darunter Gas-und partikulären Phase, war ~ 10 ¹⁶ freie Radikale ^9.

Verschiedene Ebenen des Spüleffekt von pflanzlichen Antioxidantien auf Gasphase freie Radikale in main stream Zigarettenrauch beobachtet. Deren Aufräumen Raten wurden in Abb. dargestellt. 4. Lycopin und Traubenkernextrakt zeigten die höchsten Raten bei niedrigener betrug für Pycnogenol (Abb. 4) beobachtet.

Abbildung 1. Ein Diagramm der verbesserten Rauchen Simulation Design für das Sammeln der Gasphase freie Radikale in den Mainstream-Zigarette zu rauchen (MCS) mit Spin-Trap. MCS wurde durch eine Wasserstrahlpumpe durch CA-Filter, dann Cambridge-Filter (Gelbfilter) gezogen und durch ein Flüssigstickstofffalle zu H ₂ O. entfernen Die Gasphasen-Produkten ging schließlich zu fangen Spin und sprudelte durch die Spin-Trap-Lösung. Pflanze Antioxidans wurde zwischen zwei Stücken von herkömmlichen Acetat-Filter gesetzt (Vergrößerte in Kreis A) an Zigaretten, freie Radikale im MCS abzufangen.

Abbildung 2. Eine quantitative Schätzung für die Spin-Trapping-Addukt-Konzentration in Benzol erfordert Subtrahieren einer breiten Hintergrund Signal von der ersten Integrationl Spektrums. Die Hyperfeinstruktur-Parameter für die Spin-Trapping-Addukt sind _H = 1,95 G, ein _N = 13.7G.

Abbildung 3. Passing durch LN2 Falle wesentlich verbessert die Qualität der ESR-Signale durch Spin-Trapping von MCS erhalten.

Abbildung 4. Wirkung von natürlichen Antioxidantien auf die Konzentration an freien Radikalen in MCS. Die relativen Signalintensitäten sind: Kontrolle - 100%, Pycnogenol - 55%, Traubenkernextrakt - 12%, Lycopin - 10%.

Diskussion

Eine zuverlässige Schätzung der Wirkung verschiedener Radikalfänger in Tabakrauch erfordert eine reproduzierbare Methode zur quantitativen Bestimmung der freien Radikale. Zuvor ^1, hat es sich gezeigt, dass kleine Mengen von höherer Konzentration Spin-Trap-Lösungen in nicht-polaren Lösungsmitteln am effektivsten Trapping freie Radikale aus dem Tabakrauch werden. Zigarettenrauch enthält immer Wasserdampf aus der Verbrennung von organischen Verbindungen und die Restfeuchte in Tabak, der am Ende in den Fang Lösungsmittel. Diese Beimischung von Wasser in die PBN-Spin-Trap-Lösung deutlich verringert die Lebensdauer der Spin Trapping-Addukte und die Intensität ihrer ESR-Signale. Das Entfernen dieser Feuchtigkeit durch einfache Weitergabe MCS durch eine U-förmige Röhre mit flüssigem Stickstoff gekühlt dramatisch verbessert die Qualität der ESR-Spektren in unseren Experimenten, obwohl einige Bruchteil der Gasphase Radikale können auch auf der gefrorenen Oberfläche aufgefangen werden.

Mit tseine Technik, die wir relative Effizienz verschiedener Radikalfängereigenschaften natürlichen Verbindungen in Zigarettenfilter eingeführt verglichen. Wir fanden, dass Lycopin und Traubenkernöl-Extrakt sofort nach dem Aufnehmen in Zigarettenfilter der Lage sind, abzufangen bis zu 90% von freien Radikalen aus der Gasphase MSC. Solch hohe Bindungskapazität Reihen dieser billigen leicht verfügbaren natürlichen Verbindungen zu den effizientesten berichtet freie Radikale Protektoren wie Hämoglobin und shikonine ^8,14. Doch in unseren Experimenten Zigarettenfilter mit studierte natürlichen Antioxidantien geladen verloren einen spürbaren Teil ihrer Bindungskapazität nach einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur. Die Lösung dieses Problems kann stimulieren die künftige Anwendung von Lycopin und Traubenkernextrakt in kommerziellen Zigarettenfilter.