Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

Резюме

Основной квест в клеточной биологии является определение механизмов, которые лежат в основе личности органеллы, которые делают эукариотических клеток. Здесь мы предлагаем метод для идентификации генов, ответственных за морфологической и функциональной целостности растительного органелл с помощью флуоресцентной микроскопии и следующее поколение инструментов последовательности.

Аннотация

Этот протокол описывает флуоресцентного микроскопа на основе проверки Arabidopsis саженцев и описывает, как отобразить рецессивные мутации, которые изменяют субклеточных распределение конкретных помеченный флуоресцентного маркера в секреторный путь. Arabidopsis является мощной биологической модели для генетических исследований, поскольку его размер генома, Время создания и сохранения молекулярных механизмов между царствами. Массив генотипирования, как подход к карте мутации в альтернативу традиционным методом, основанным на молекулярные маркеры выгодно, потому что это сравнительно быстрый и может разрешить отображение нескольких мутантов в очень короткие сроки. Этот метод позволяет идентифицировать белки, которые могут повлиять на целостность любой органеллы растений. Здесь, как, например, мы предлагаем экран карту генов, важных для целостности эндоплазматического ретикулума (ЭР). Наш подход, однако, можно легко распространить и на другие органеллы растительной клетки(См., например, ^1,2), и, следовательно, представляет собой важный шаг на пути к пониманию молекулярных основ, регулирующих другие субклеточные структуры.

протокол

1. EMS лечение

Arabidopsis семена THALIANA которые мутагенизированный, используя в качестве мутагенного агента этилового метан сульфонат (EMS) ^3,4, которое индуцирует в геном C-к-T изменения, приводящие к C / G Т / мутаций ^5-7.

1. Взвесить 0,8 г семян Arabidopsis (~ 40 000 семян) проведение маркер органелл люминесцентные (в частности, в этом исследовании ssGFPHDEL (сигнал последовательности GFP-HDEL тетрапептид) был использован в качестве маркера ER).
2. Передача семена в 50 мл трубку сокол, а затем добавить 25 мл дистиллированной воды.
3. Добавить 0,2% (объем / объем) этилового метан сульфонат.
4. Выдержите в течение 16 часов на nutating миксером на низкой скорости.
5. Аспирацию жидкости и отбросить его в колбу, содержащую 1,0 М NaOH, чтобы инактивировать EMS.
6. Добавить 25 мл воды в трубе Сокол содержащие семена, близкие, и инвертировать в 5 раз, чтобы вымыть семена, ждать, пока все семена урегулирован, то аспирация воды и выбросить в 1,0 М Na ОН колбу.
7. Повторите промывки до 10 раз.
8. После последней промывки, вновь приостановить семена в минимальном количестве воды.
9. Приступить к стерилизации семян добавлением 25 мл 10% гипохлоритом натрия, энергично встряхивают в течение 30 сек. Пусть семена оседают на дно, затем слить и промыть отбеливателя с 25 мл стерильной воды. Вылейте стерильной воды и добавить 25 мл 70% этанола. Встряска трубы в течение 30 сек. Пусть семена оседают на дно. Слейте и промойте этанола с 25 мл стерильной воды. Повторите два раза промыть стерильной водой, затем заливают семян на пластиковые чашки Петри, содержащей 3 мм фильтровальную бумагу и дайте высохнуть под капотом. Хранить при температуре 4 ° С в течение 2 дней.
10. Пластина семян на ½ MS phytagel (половина средней концентрации Мурасиге и Скуга), 150-мм чашки Петри (~ 250-300 семян на табличке).
11. Рост M1 семян на пластине в течение 2 недель, а затем пересадить в почву.
12. Сбор семян М2 отдельных M1 растений для создания линии M2 (1000 независимых линий).

ove_title "> 2. конфокальной Скрининг M2 и M3 населения

В этом разделе мы описываем наблюдения саженцев с конфокальной или флуоресцентного микроскопа, как описано выше ^8.

1. Шестьдесят семена из каждой линии М2 выросла на 7 до 10 дней на пластиковые чашки Петри, ½ MS phytagel, на той же пластинке также выращивают рассаду 5 EMS-необработанных (контроль).
2. Пять-десять семядоли монтируются с абаксиальной стороны в сторону объектива (40X) на предметное стекло и заключены с покровным.
3. Каждый семядолей наблюдается, начиная с коры на медиальной области, по флуоресценции для любых измененных субклеточных распределение маркеров органелл.
4. Положительные растения пересаживают в почву и семена собирают и обследование для подтверждения мутантного фенотипа в поколение M3.
5. Удалить загрязнения фоне мутации по беккросс по крайней мере три раза, чтобы дикого типа генома возможно совместноntaining желаемого органелл флуоресцентный маркер.
   1. От материнского растения, с помощью тонких ножниц или щипцов удалите зрелые стручки, и распускающиеся цветы.
   2. Удаление почки, которые слишком малы из меристемы.
   3. Вставьте кончик одной паре щипцов между лепестками и чашелистиками, чтобы открыть один бутон цветка и удалить все пыльники.
   4. Использование одной пары щипцов принимать открытое зрелые цветы от отца завод и протрите пыльников на рыльце выхолощенной завода.

3. Сопоставление

В этом разделе описываются по существу, как отобразить рецессивные мутации с использованием модифицированного протокола от Borevitz ^9, который работает быстрее, по сравнению с традиционными методами отображения ^10,11. Такой подход использования высокой плотности массива олигонуклеотида с возможностью обнаружить многочисленные одного полиморфизма функция (SFP) в одном тесте ^12. Использование Arabidopsis Affymetrix ATH1 GeneChip массив можноанализировать около 24 000 генов. Пул F ₂ лица показывает мутации по сравнению с бассейном дикого типа F ₂ растения, собранные в одном разделения населения. Затем, мутация будет отображаться в области, где мутант бассейн обогащается за мутантных аллелей генотипа и, следовательно, в этом же районе дикого типа бассейн приведет обогащенные для дикого типа родитель аллелей ^13.

1. Геномная ДНК (3 мкг) извлекается из гомозиготных мутантов Колумбия (M3) с помощью завода Qiagen DNeasy Mini Kit и представлен на Illumina Genome Analyzer II (ГА II) ¹⁴ последовательности.
2. Гомозиготных мутантов Колумбия (M3) пересекается с Ландсберг erecta для создания отображения населения.
3. Отображение осуществляется на 70 до 100 F2 лиц показывает аномальным фенотипом и такое же количество F2 растений дикого типа фенотипа.
4. Сбор с каждого растения лист диска (0,60 мм) с помощью дырокола.лист диска должна быть собрана из листьев одного и того же возраста обязательно иметь одинаковое количество ДНК. Образцы могут быть обработаны для геномной добыча по отдельности или группами. В этом случае, можно собрать 5-10 образцов для каждой пробирки Эппендорф, так что в конце концов, у вас будет меньше Эппендорф труб из геномной ДНК, которые должны быть извлечены.
5. MasterPure листьев растений ДНК Очистка Kit (Эпицентр) используется для получения геномной ДНК. Геномной ДНК, полученной из каждого образца количественно с nanodrop.
6. Такое же количество геномной ДНК из каждого образца затем собрали в общей сложности до 300 нг (~ 30 мкл) растений ДНК, добавить 60 мкл 2.5X случайное решение грунтовки [125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 12,5 мм MgCl2, 25 мМ 2-меркаптоэтанол, 750 мкг / мл праймера oligodeoxyribonucleotide (случайная октамеры)] (Bioprime комплект) и 42 мкл воды (конечный объем 132 мкл).
7. Денатурации ДНК в> 95 ° C в течение 5 до 10 мин.
8. Прохладный на льду.
9. Для каждого denatuкрасный ДНК добавляют 15 мкл 10X смесь дНТФ с биотин дЦТФ [1 мМ биотин-14-дЦТФ, 1 мМ дЦТФ, 2 мМ дАТФ, 2 мМ дГТФ, 2 мМ дТТФ в 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ Na2EDTA] (Bioprime комплект), а в комплекте с 3 мкл полимеразы Кленова (Bioprime комплект).
10. Выдержите в течение ночи при 25 ° C.
11. На следующий день, добавить 15 мкл 3 М NaOAc и 400 мкл холодного 100% этанола, перемешать.
12. Инкубировать при температуре -80 ° С в течение 1 часа, затем вращаться 20500 мкг в течение 15 мин, удалить супернатант, и промыть 500 мкл холодного 75% этанола.
13. Спиновая на 20 500 мкг в течение 10 мин.
14. Гранулы сухого ДНК при 37 ° С в течение 10 минут и ресуспендируют в 100 мкл воды.
15. Используйте 5 мкл проверить урожайность и качество на гель (рис. 2).
16. Отправить 95 мкл маркировки реакция дикого типа и мутантных для GeneChip Arabidopsis ATH1 гибридизации генома массива.
17. Массивы сканирования и. CEL файлы, полученные анализируются с помощью программного обеспечения R ( http://www.r-project.oге /).
18. Установка программного обеспечения R, а затем открыть программу и вставьте следующую строку:
    источник (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
    biocLite ()
    Затем нажмите клавишу возврата ключей будет установлен стандартный пакет Bioconductor ( http://www.bioconductor.org ).
19. В новую папку на рабочем столе, загрузить со следующего веб-сайта ( http://www.naturalvariation.org/methods ) файлов:
    readcel.R
    SFP.R
    Map.R
    ath1V5.RData
    ColLerCEL.zip
    ColLerCEL.zip файл необходимо распаковать и полученные файлы вставлен в новую папку.
20. Переименовать данные, полученные от вашего GeneChip эксперимент в wildtype.CEL и mutant.CEL.
21. Скопируйте теперь данные GeneChip (wildtype.CEL иmutant.CEL) в папку.
22. Открытое R, а) для Mac: нажмите "Разное", а затем нажмите кнопку "Изменить рабочий каталог". б) для ПК: нажмите кнопку "Файл", затем "Изменить каталог"
23. а) для Mac: Выберите папку, содержащую файлы. Нажмите кнопку "Рабочее пространство", "файл рабочей нагрузки" и выберите ath1V5.RData, б) для ПК: Выберите папку, содержащую файлы выше, нажмите кнопку "Файл", затем "Загрузить рабочее пространство" и выберите ath1V5.RData.
24. Открытое readCEL.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
25. Открытое SFP.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
26. Открытое Map.R с помощью блокнота и скопировать весь текст Р.
27. В окне консоли вы увидите следующее сообщение:
    Х-хромосома ограничивает Mb уг
    Поиск генов ТАИР вставить ссылку
    3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=yИ конец = Z
28. Скопируйте и вставьте ссылку в ваш интернет-браузер. Появится окно, и просим, ​​чтобы открыть или сохранить файл, вы должны выбрать сохранить. Выберите имя файла и прикрепите с расширением ". XLS", нажмите кнопку Сохранить.
29. Откройте файл ". XLS", где Вы можете найти координаты для мутантов (результат наглядно представлены на рисунке 3).
30. В подключенных области в собранном Illumina читает мутантного генома определить конкретные переходы EMS ^{4 место} среди одиночных нуклеотидных полиморфизмов. Дополнение мутантного фенотипа путем трансформации гена дикого типа (типов) с использованием стандартных процедур ^15.

4. Представитель Результаты

На рисунке 1 показан подход, используемый для идентификации мутантных секреторного пути с помощью конфокальной микроскопии скрининга. На рисунке 2 показан типичный подготовки меченой геномной ДНК гибридизации для массива. На рисунке 3, типичный результат ожидается после анализа данных, полученных из GeneChip Arabidopsis массива генома ATH1 представлен.

Рисунок 1. Arabidopsis трансгенных растений, экспрессирующих ssGFPHDEL (ER маркер) (1) культивировали производить достаточное количество семян для лечения EMS (2). Семена обрабатывают EMS затем были посеяны для создания M1 растения (3). Каждое растение представляет M1 различные линии и семена были собраны отдельно от каждого из них. М2 семена высевают на ½ MS субстрата (4), а затем обследование на наличие дефектов в морфология ER с помощью конфокальной микроскопии (5). Во время обследования мы обнаружили растения, которые сохраняются дикого типа ER морфологии (6) и растений, которые показывают, дефектный фенотип ER (7). Эти растения были выращены для получения M3 поколения и подтвердить фенотип (8). Геномная ДНК из растительных M3 была использована для Solexa Illumina последовательности (а). То же самое растениебыл также использован для скрещивания с Лер-масс для получения F2 населения отображения (б).

Рисунок 2. Bioprime случайных реакций маркировки (5 мкл 100 мкл) были загружены на агарозном геле 1%. Переулок от бассейна дикого типа F2 растений, а полоса Ъ из числа мутантных растений F2. (Маркера составляет 1 Kb ДНК лестница-N3232, от NEB).

Рисунок 3. Фигура представляет собой пример отображения Кол-0 мутация использованием GeneChip Arabidopsis ATH1 генома массива гибридизации. Мутация в этом примере находится на разделителями хромосомы 1, вертикальные полосы. Горизонтальных полос представляют пороги обнаружения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описали конфокальной микроскопии скрининга для идентификации endomembrane мутантов. Этот подход можно легко распространить и на другие органеллы клетки, для которых конкретные флуоресцентные маркеры белка имеются. Экран на основе идентификации мутантов, которые показывают, анома...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Ethylmethane сульфонат	Сигма	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Мурасиге Скуга базальной среды со Гамборга витамины	Фито Технолог laboratorie	M404
Phytagel	Сигма	P8169-1 кг
RNeasy комплект мини	Qiagen	74104
Мастер чистого листа растения очистки ДНК комплект	Эпицентр	MPP92100
Bioprime система маркировки ДНК	Invitrogen	18094-011
Алкоголь 200 доказательство	Декан Laboratories Inc.	2716
NaOAc	JT Baker
Генных чипов Arabidopsis ATH1генома массив	Affymetrix	900385
Сокол трубы 50 мл	гранулирование	430290
Эппендорф трубы 1,5 мл
Фильтровальная бумага 90 мм	Ватман	1001090
Аналитические весы	Mettler Toledo AB54-S	не доступно
Nutating (волны) шейкер	Heidolph Polymax 1040	не доступно
Центрифугировать	Эппендорф 5417-R	не доступно