Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Riepilogo

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Abstract

Questo protocollo descrive un microscopio a fluorescenza basato su uno screening di piantine di Arabidopsis e descrive come mappare le mutazioni recessive che alterano la distribuzione subcellulare di uno specifico tag marker fluorescente in via secretoria. Arabidopsis è un potente modello biologico per gli studi genetici a causa della sua dimensione del genoma, tempo di generazione, e la conservazione dei meccanismi molecolari tra i regni. La matrice genotipizzazione come un approccio per mappare la mutazione in alternativa al metodo tradizionale basato su marcatori molecolari è vantaggiosa poiché è relativamente veloce e può consentire la mappatura dei diversi mutanti in un lasso di tempo molto breve. Questo metodo consente l'identificazione di proteine ​​che possono influenzare l'integrità di eventuali organello nelle piante. Qui, come esempio, si propone una schermata per mappare geni importanti per l'integrità del reticolo endoplasmatico (ER). Il nostro approccio, tuttavia, può essere facilmente estesa ad altri organelli cellulari vegetali(Si veda per esempio ^1,2), e rappresenta quindi un passo importante verso la comprensione delle basi molecolari che regolano le altre strutture subcellulari.

Protocollo

1. EMS Trattamento

Semi di Arabidopsis thaliana sono mutagenizzato utilizzando come agente mutageno metano solfonato di etile (EMS) ^3,4, che induce nelle C-to-T genoma cambi derivanti in C / G a T / A mutazioni ^5-7.

1. Pesare 0,8 g di semi di Arabidopsis (circa 40.000 semi) che trasportano il marcatore fluorescente organello (specificamente, in questo studio ssGFPHDEL (sequenza segnale-GFP-HDEL tetrapeptide) è stato usato come marcatore ER).
2. Trasferire i semi in un tubo da 50 ml Falcon, poi aggiungere 25 ml di acqua distillata.
3. Aggiungere 0,2% (v / v) metano solfonato etile.
4. Incubare per 16 ore su oscillante miscelatore a bassa velocità.
5. Aspirare ed eliminare il liquido in un pallone contenente 1,0 M NaOH per inattivare l'EMS.
6. Aggiungere 25 ml di acqua nella provetta Falcon che contiene i semi, chiudere e capovolgere 5 volte per lavare i semi; attendere che tutti i semi si sono stabiliti, quindi aspirare l'acqua e gettare nel 1,0 M Na OH pallone.
7. Ripetere la fase di lavaggio fino a 10 volte.
8. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i semi in una quantità minima di acqua.
9. Procedere alla sterilizzazione delle sementi aggiungendo 25 ml di candeggina al 10%, si agita energicamente per 30 s. Lasciate che i semi depositerà sul fondo, quindi versare off candeggina e sciacquare con 25 ml di acqua sterile. Versare l'acqua sterile e aggiungere 25 ml di etanolo al 70%. Agitare provette per 30 s. Lasciate che i semi depositerà sul fondo. Versare etanolo e sciacquare con 25 ml di acqua sterile. Ripetete due volte il lavaggio con acqua sterile, poi versate i semi su un piatto di plastica Petri contenente 3 mm Carta filtro e lasciare asciugare sotto il cofano. Conservare a 4 ° C per 2 giorni.
10. Piastra i semi sulla ½ MS phytagel (concentrazione media la metà di Murashige e Skoog), 150 mm Petri (circa 250-300 semi per piastra).
11. Crescere semi M1 sul piatto per 2 settimane, poi trapiantare nel terreno.
12. Raccogliere i semi M2 da singoli impianti per generare linee M1 M2 (1000 linee indipendenti).

ove_title "> 2. Screening confocale delle popolazioni M2 e M3

In questa sezione descrive l'osservazione di piantine con un microscopio confocale a fluorescenza o come descritto in precedenza ^8.

1. Sessanta semi di ogni linea M2 sono cresciuti da 7 a 10 giorni in plastica piastre di Petri, ½ MS phytagel, sulla stessa piastra vengono coltivate anche 5 piantine di EMS-non trattati (controllo).
2. Da cinque a dieci cotiledoni sono montati con il lato abassiale verso l'obiettivo (40X) su un vetrino da microscopio e chiuso con coprioggetto.
3. Ogni cotiledone si osserva, dalla corticale alla regione mediale, in fluorescenza per ogni distribuzione subcellulare alterata del marcatore organello.
4. Impianti positivi vengono trapiantate nel terreno ed i loro semi sono raccolti e selezionati per confermare il fenotipo mutante nella generazione M3.
5. Rimuovere i contaminanti mutazioni di fondo attraverso backcrossing almeno tre volte a una wild-type genoma eventualmente containing il marcatore desiderato organello fluorescente.
   1. Dalla pianta madre, usando le forbici o pinze sottili rimuovere silique mature e fiori aperti.
   2. Rimuovere le gemme che sono troppo piccoli da meristema.
   3. Inserire la punta di una coppia di pinze tra petali e sepali di aprire uno bocciolo di fiore e rimuovere tutte le antere.
   4. Utilizzando una coppia di pinze prendere un fiore aperto matura dalla pianta padre e strofinare le antere sullo stimma della pianta snervante.

3. Mapping

Questa sezione descrive essenzialmente come mappare una mutazione recessiva utilizzando un protocollo modificato dal Borevitz ^9, che è più veloce rispetto ai metodi tradizionali di mappatura ^10,11. Questo approccio utilizza array ad alta densità oligonucleotidici con la capacità di rilevare numerose tecniche singoli polimorfismi (SFP) in un singolo test ^12. Utilizzando la Arabidopsis Affymetrix ATH1 serie GeneChip è possibileanalizzare i circa 24.000 geni. Un pool di F ₂ individui che mostrano la mutazione viene confrontato con un pool di wild-type F ₂ piante raccolte all'interno della stessa popolazione segregante. Poi, la mutazione verrà mappato nella regione in cui si arricchisce il pool mutante per alleli mutanti genotipo e di conseguenza nella stessa regione il wild-type piscina risulterà arricchito per l'alleli wild-type genitori ^13.

1. Il DNA genomico (3 mg) viene estratto dal omozigote mutante Columbia (M3) utilizzando un impianto Qiagen DNeasy Mini Kit e viene sottoposto Illumina Genome Analyzer II (GA II) ¹⁴ sequenziamento.
2. Il omozigote mutante Columbia (M3) è attraversata con Landsberg erecta per generare una popolazione di mappatura.
3. La mappatura viene eseguita su 70 fino a 100 individui F2 mostrano il fenotipo aberrante e lo stesso numero di piante F2 con un fenotipo di tipo selvatico.
4. Raccogliere da ogni pianta un disco foglia (0,60 mm) utilizzando un punteruolo. Ildisco di foglia devono essere raccolti dalle foglie della stessa età per essere sicuri di avere simili quantità di DNA. I campioni possono essere trattati per l'estrazione genomico separatamente o in gruppi. In questo caso, è possibile raccogliere campioni 5-10 per ogni provetta Eppendorf in modo che alla fine si avrà meno provette Eppendorf da DNA genomico che deve essere estratto.
5. Impianto MasterPure Leaf DNA Purification Kit (Epicentre) viene utilizzato per estrarre il DNA genomico. Il DNA genomico ottenuto da ciascun campione viene quantificata con un NanoDrop.
6. La stessa quantità di DNA genomico da ciascun campione viene poi messo insieme fino a un totale di 300 ng (~ 30 mL) di DNA vegetale; aggiungere 60 ul 2.5X soluzione primer casuale [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-mercaptoetanolo, 750 pg / ml primer oligodeoxyribonucleotide (octamers casuali)] (Bioprime kit) e 42 microlitri di acqua (volume finale 132 pl).
7. DNA denaturano a> 95 ° C per 5 a 10 min.
8. Raffreddare su ghiaccio.
9. Ad ogni denaturosso DNA aggiungere 15 ul miscela dNTP 10 volte con biotina dCTP [1 mM biotina-14-dCTP, dCTP 1 mM, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, dTTP 2 mM a 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), e completare con 3 polimerasi Klenow microlitri (kit Bioprime).
10. Incubare per una notte a 25 ° C.
11. Il giorno seguente, aggiungere 15 microlitri 3 M NaOAc e 400 microlitri freddo EtOH 100%; mix.
12. Incubare a -80 ° C per 1 ora, poi girare a 20.500 xg per 15 min, rimuovere supernatante, e lavare con 500 microlitri EtOH freddo 75%.
13. Spin a 20.500 xg per 10 min.
14. Pellets di DNA a secco a 37 ° C per 10 min e risospendere in 100 microlitri di acqua.
15. Utilizzare 5 microlitri per controllare resa e qualità su un gel (Figura 2).
16. Invia 95 microlitri di etichettatura di reazione per il wild-type e mutanti per l'ibridazione Arabidopsis Genome Array GeneChip ATH1.
17. Gli array vengono scansionati ed i. CEL file ottenuti sono analizzati utilizzando il software R ( http://www.r-project.org /).
18. Installare il software R, quindi aprire il programma e incollare la seguente stringa:
    fonte (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
    biocLite ()
    Poi premere il tasto-questo ritorno installerà i pacchetti standard (Bioconductor http://www.bioconductor.org ).
19. In una nuova cartella sul desktop, scaricare dal seguente sito Web ( http://www.naturalvariation.org/methods ) i file:
    readcel.R
    SFP.R
    Map.R
    ath1V5.RData
    ColLerCEL.zip
    Il ColLerCEL.zip file deve essere decompresso ed i file risultanti incollato nella nuova cartella.
20. Rinominare i dati ottenuti dall'esperimento GeneChip in wildtype.CEL e mutant.CEL.
21. Copiate ora i tuoi dati GeneChip (wildtype.CEL emutant.CEL) nella cartella.
22. Apri R, a) per Mac: fare clic su "Misc" e quindi fare clic su "Cambia directory di lavoro." b) per PC: fare clic su "File" "Cambia directory" e poi
23. a) per Mac: selezionare la cartella contenente i file. Fare clic su "Area di lavoro", "spazio di lavoro Load File" e selezionare ath1V5.RData, b) per PC: selezionare la cartella contenente i file di cui sopra, cliccare su "File", poi "Load workspace" e selezionare ath1V5.RData.
24. ReadCEL.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l'intero testo di R.
25. SFP.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l'intero testo di R.
26. Map.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l'intero testo di R.
27. Nella finestra della console verrà visualizzato il seguente messaggio:
    Cromosoma x limita Mb yz
    I geni della ricerca a TAIR incollare questo link
    3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& End = z
28. Copia e incolla il link nel proprio browser internet. Apparirà una finestra e chiedere di aprire o salvare il file, si dovrebbe selezionare Salva. Scegli un nome di file e fissare l'estensione ". Xls", quindi fare clic su Salva.
29. Aprire il file ". Xls" dove si possono trovare le coordinate per il vostro mutante (il risultato è rappresentato graficamente in Figura 3).
30. All'interno dell'area mappata nel Illumina assemblato legge del genoma mutante identificare specifiche transizioni EMS ^quattro tra i polimorfismi a singolo nucleotide. Completano il fenotipo mutante mediante trasformazione con il gene wild type (s) utilizzando le procedure standard ^15.

4. Risultati rappresentativi

La figura 1 mostra l'approccio utilizzato per l'identificazione di un mutante di percorso secretorio di screening utilizzando la microscopia confocale. Figura 2 mostra una tipica preparazione di DNA genomico marcato per ibridazione matrice. In figura 3, un tipico risultato atteso dopo l'analisi dei dati ottenuti dalla Array GeneChip Arabidopsis Genome ATH1 viene presentato.

Figura 1. Piante di Arabidopsis transgeniche esprimenti ssGFPHDEL (ER marker) (1) sono stati coltivati ​​per produrre abbastanza semi per EMS trattamento (2). I semi trattati con EMS sono stati poi seminati per generare piante M1 (3). Ogni pianta M1 rappresenta una linea diversa e semi sono stati raccolti separatamente da ciascuno di essi. Seme M2 sono state piastrate su substrato ½ MS (4) e poi sottoposti a screening per difetti di morfologia ER tramite microscopia confocale (5). Durante la proiezione abbiamo trovato piante che conserva la wild-type morfologia ER (6) e le piante che mostrano fenotipi difettosi ER (7). Queste piante sono state coltivate per ottenere la generazione M3 e per confermare il fenotipo (8). Il DNA genomico di pianta M3 è stato utilizzato per Solexa Illumina sequenziamento (a). La stessa piantaè stato utilizzato anche per gli incroci con Ler-peso per ottenere la popolazione F2 mappatura (b).

Figura 2. Reazioni Bioprime etichettatura random (5 pl di 100 pl) sono stati caricati su gel di agarosio 1%. Lane, uno è da un pool di piante F2 wild-type, e Lane b è da un pool di piante mutanti F2. (Marker è 1 Kb DNA ladder-N3232, da NEB).

Figura 3. La figura rappresenta un esempio di mappatura delle Col-0 mutazione utilizzando Arabidopsis GeneChip ATH1 Genome Hybridization Array. La mutazione in questo esempio è situato sul cromosoma 1 delimitato, da barre verticali. Le barre orizzontali rappresentano le soglie per il rilevamento.

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Discussione

Qui descritto un microscopio confocale a base di screening per l'identificazione dei mutanti endomembrane. Questo approccio può essere facilmente estesa ad altri organelli della cella per cui specifici marcatori proteici fluorescenti sono disponibili. Lo schermo si basa sulla individuazione di mutanti che mostrano una distribuzione aberrante del marcatore fluorescente o in organello bersaglio o organelli che non dovrebbero contenere il marcatore. Rispettivamente, questi mutanti rappresentano popolazioni in cui è c...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Ethylmethane solfonato	Sigma	M0880
NaOH	JT Baker	3722-05
Murashige Skoog basali medi w Gamborg vitamine	Phyto technolog labor	M404
Phytagel	Sigma	P8169-1Kg
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Maestro vegetale puro foglia DNA kit di purificazione	Epicentre	MPP92100
Bioprime DNA sistema di etichettatura	Invitrogen	18094-011
Alcohol 200 prove	Decan laboratori inc.	2716
NaOAc	JT Baker
Gene Chip ATH1 Arabidopsisarray di genoma	Affymetrix	900385
Provette Falcon 50 mL	corning	430290
Provette Eppendorf 1,5 mL
Carta da filtro 90 millimetri	Whatman	1001090
Bilancia analitica	Mettler Toledo AB54-S	na
Contalitri volumetrico (wave) shaker	Heidolph Polymax 1040	na
Centrifuga	Eppendorf 5417-R	na