Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Резюме

Микобактерий туберкулеза лекарственных форм терпимо биопленки при культивировании в определенных условиях. Здесь мы опишем методы культивирования M. туберкулез биопленки и определения частоты наркотиков терпимо persisters. Эти протоколы будут полезны для дальнейших исследований в механизмах толерантности препарата в М. туберкулезом.

Аннотация

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis ¹, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms ^2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) ^5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms ⁷.

In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin ^8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere ⁹. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc²7000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen ⁹. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.

Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

протокол

1. Рост биопленки М. туберкулезом в 250 мл винт крышками бутылки

1. СМИ приготовления: Растворите 0,5 г KH ₂ PO _4, 0,5 г MgSO _4, 4 г L-аспарагин, 2 г лимонной кислоты, 0,05 г железа цитрат аммония, 60 мл глицерина в 900 мл воды. Скорректировать значение рН до 7,0 с NaOH. Автоклав, остудить и только до начала эксперимента, добавить стерильный ZnSO ₄ до конечной концентрации 0,1% вес / С mс ² 7000 пантотенат ауксотроф этого штамма также требует пантотеновой кислоты в 10μg/mL конечной концентрации.

Примечание: Это стандартный состав СМИ Sauton, используемой для микобактерий туберкулеза. Однако, в случае необходимости другие специализированные средства массовой информации могут также быть использованы для других видов микобактерий.

2. Inoculums подготовки: Расти М. туберкулезом в 7H9OADC с 0,05% Твин-80 в течение одной недели, или OD ₆₀₀ от 0,7 до 1,0. У.е.lture могут быть непосредственно использованы в качестве посевного в разведении 1:100.
3. Внесите 25 мл СМИ Sauton на 250 мл винт крышками бутылки полистирола (Corning). Добавить 250 мкл посевного в среду, крышка очень плотно бутылку и поместите его спокойно, в увлажненной 37 ° C инкубаторе в течение 3 недель. Обратите внимание на бутылку раз в день, чтобы обеспечить, что нет загрязнений.
4. В конце третьей недели, ослабьте крышку бутылки, чтобы дальнейший рост M. туберкулезом на границе. Если крышка не ослабил на данном этапе, то недостаточная концентрация кислорода в контейнере будет тормозить дальнейший рост бактерий.

2. Рост М. туберкулез биопленки в 12-луночных

1. Подготовка информации и посевной тс ² 7000, как описано в разделе A1 и A2.
2. Смешайте 60 мл среды с 600μl инокулята. Внесите 4,5L смеси в каждую лунку пластинки. Закройте планшет крышкой. Оберните пластинка несколько раз парафильмом. Инкубируйте планшет спокойно в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 недель.

3. Определение частоты лекарственной терпимо persisters в М. туберкулез биопленки

1. Рост М. туберкулез биопленки в 12-луночного формата, как описано в разделе B. Это займет в общей сложности около 5-ти недель.
2. После биопленки созрела (после 5 недель инкубации) вводить ваш выбор антибиотика в нужной концентрации в средствах массовой информации под биопленки помощью микроострийных в пипетку.

Примечание: Объем средств массовой информации под пленок уменьшается примерно 3.0mL. Таким образом, исследователи должны соответственно рассчитать количество препарата.

3. Swirl пластины аккуратно, чтобы антибиотик полностью распространяется в среде. Для статистически значимые результаты, впрыскивают антибиотиковслуховым в четырех скважин. Параллельно вводят тот же объем растворителя, в котором антибиотик был распущен и в других четырех скважин, а также оставить за последние четыре скважины пластины нетронутыми. Закройте планшет крышкой и поставить свежие слои парафильмом вокруг плиты. Положите ее обратно в инкубатор для желаемого периода времени.
4. В конце инкубации, откройте плиты и добавить Твин-80 в конечной концентрации 0,1% (объем / объем) в каждой из скважин. Swirl целую тарелку мягко для равномерного рассеивания моющего средства. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 15 минут. Смешать содержимое каждой лунки с пипетки несколько раз, так что весь контент может быть равномерно передается 15 мл коническую трубку.
5. Спином вниз содержимое тубы на 4000rpm в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 5 мл свежего промывочным буфером (PBS с 10% глицерина и 0,05% Твин-80). Повторите мытье в три раза. Ресуспендируют гранул в 5 мл промывочного буфера. Держите его на коромысло для оvernight при 4 ° C.

Примечание: Несмотря на низкую температуру первоначально была разработана для М. smegmatis (для уменьшения его роста в дисперсии) и используется для микобактерий туберкулеза, а также, медленно растущих видов может, скорее всего, качал при комнатной температуре без какого-либо влияния на результат. Раскачивание при комнатной температуре может быть необходимо, если работать в BSL-3 объекта.

6. Подготовка стерильного шприца снабжены микроострийных (2 200 мкл) за счет сокращения его широкий конец в подходящий размер, установка его в шприц и, окружив его с парафильмом. Передать все содержимое трубки через зонд-оборудованная шприц и собирать в свежем 15 мл пробирки. Повторите этот шаг 5 до 6 раз, пока не наблюдается довольно однородной суспензии.
7. Подготовка серийного разведения подвески и пластины разведения на 7H11OADC пластины для определения количества жизнеспособных колоний в каждую лунку. Инкубируйте пластины в течение трех недель в 37 ° C инкубатора. Определение частотыСай о persisters в биопленки населения путем расчета соотношения числа колоний, полученных в лечение антибиотиком, полученным на растворитель рассматривается пластин.

4. Представитель Результаты

При культивировании в бутылке, рост M. туберкулез можно увидеть на базе бутылку к концу первой недели. К концу второй недели, пятнистый рост бактерий в эфире информации интерфейс можно увидеть, хотя рост на воздушной среды интерфейс постоянно видимый в конце третьей недели (рис. 1А). В это время прикрепления бактерии к стенке контейнера наблюдается. С этого момента рост культуры в первую очередь происходит в эфире информации интерфейсом. Жидкости под поверхностью рост очевиден. Как правило, структура созревает к концу пятой недели (рис. 1б). Если инкубация удлиняется, структуры начнут опускаться на дно контейнера. Интересно, чтоужесточение крышку до конца третьей недели, является важным шагом в процессе, и по неизвестным причинам свободные крышками бутылки значительно задерживает начало роста на границе ^9.

В 12-луночного формата, надежные биопленки на воздушной среды интерфейс видел в каждом из скважины в конце пять недель (рис. 2A). Если пластины не полностью обернут то дифференциальный рост биопленки не наблюдается. В худшем случае, значительное испарение средства массовой информации могут остановить рост бактерий (рис. 2В). Таким образом, упаковка пластины необходимо как для предотвращения испарения, а также обеспечить условия для формирования биопленок (см. предыдущий абзац).

Количество жизнеспособных бактерий в биопленках определяется с помощью этой техники достаточно воспроизводимыми. Ответ М. туберкулез биопленки зависит от природы антибиотиков. Для бактерицидными антибиотиками, такие как рифампицин, потеря жизнеспособности следующим bipha оригинале тенденции ^9. Быстрое снижение жизнеспособности в течение первых трех-четырех дней с последующим постоянным фаза, в которой небольшая часть населения по-прежнему полностью непокорных к антибиотикам, независимо от концентрации антибиотиков и времени экспозиции. На рисунке 3 показано количество жизнеспособных бактерий в зрелые биопленки после 7-дневного воздействия 50μg/mL (в 50 раз выше, чем МИК) рифампицин.

Рисунок 1А. Раннее появление М. туберкулез бактерии в эфире информации интерфейс бактерий через 3 недели инкубации.

Рисунок 1B. Выдержанная биопленки М. туберкулеза в эфире информации интерфейса после пяти недель инкубации.

820/3820fig2A.jpg "/>
Рисунок 2А. 5-недельных биопленки М. туберкулезом выросла в 12-и формата.

Рисунок 2B. Неудачной попытки роста микобактерий туберкулеза биопленки в 12-луночного планшета без парафильмом.

Рисунок 3. Представитель график, показывающий частоту наркотиков терпимо persisters в М. туберкулез биопленок, выращенных в 12-луночного формата и подвергаются 50μg/mL рифампицина в течение семи дней.

Обсуждение

Туберкулез (ТБ), вызванный в заражении микобактериями туберкулеза, остается серьезной угрозой для общественного здравоохранения. Почти одна треть населения в мире, по оценкам, бессимптомно инфицированных возбудителем, около 9 миллионов новых случаев заболевания появляются в кли?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G