Подготовка миелоидного Производные супрессоров (MDSC) от наивного и опухоли поджелудочной железы мышей использованием проточной цитометрии и автоматизированных магнитных активированный сортировки клеток (AutoMACS)

Резюме

Это быстрый и всеобъемлющий метод иммунофенотипирования миелоидного Производные супрессоров (MDSC) и обогащению Gr-1 ⁺ Лейкоцитов из селезенки мышей. Этот метод использует проточной цитометрии и сортировки клеток AutoMACS обогатить жизнеспособных Gr-1 ⁺ Лейкоцитов до FACS сортировки MDSC для использования В естественных условиях И В пробирке Анализ.

Аннотация

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer^1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens⁷. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to naïve counterparts^7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression^11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.

Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to naïve MDSC ¹³. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of naïve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1⁺ leukocytes from naïve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1⁺ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1⁺ leukocytes from spleens of naïve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas naïve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from naïve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1⁺ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1⁺ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (naïve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

протокол

Перед началом, подготовить следующие решения:

3% Окрашивание Media (SM):

-3% Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в 1X фосфатного буфера солевым раствором (PBS)

MACS буфера (МБ):

- 0,5% альбумина из бычьей сыворотки (BSA) в 1XPBS

1. Урожай из селезенки мышей

1. Подкожно вводят 6-8 недельного возраста C57BL / 6 (Харлан) с 1,5 х 10 ⁵ клеток мышиной Panc02 приостановлены в 100 мкл 1x PBS (опухоль, туберкулез). Контрольные мыши (наивно) получают 100 мкл 1XPBS.
2. Приблизительно 4 недели после инъекции, усыпить мышей углерода удушья газом.
3. Урожай из селезенки мышей тупой диссекции с помощью щипцов и ножниц, то весят использованием баланса. Место селезенки в отдельных, обозначенных 50 мл конические пробирки, содержащие 1 х PBS.

2. Создание единой клеток Suspensioп Лейкоциты из селезенки

Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях под биологической безопасности Гуд и клеток и антител держится на льду.

1. Соберите клеточная диссоциация сито, вставив сито в открытии чашку ко дну. Затем вставьте стопорное кольцо в резьбовое области с прорезями вверх и использовать кольцо ключ для затяжки стопорного кольца, тем самым удерживая экран на месте. Поместите собранный сито в чашку Петри, содержащую 10 мл 1 х PBS.
2. Бассейн селезенки и пестик использование стекла для измельчения селезенки с сеткой ячейки сита и диссоциации в чашке Петри. Повторите для каждой группы мышей.
3. Фильтры клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку использованием 70 мкм фильтр клетке и 5 мл серологические пипетки. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл 1 х лизиса буфера в селезенке. Внесите вверх и вниз энергично. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин. Остановить реакцию, добавив 20 мл 1 х PBS. Внесите вверх и вниз энергично. Центрифуга при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мл стерильной 1 х PBS. Внесите вверх и вниз энергично.
6. Граф клеток с использованием трипанового синего и hemacytometer и ресуспендируют в нужной концентрации в 3% SM, так что 50 мкл эквивалентно 5x10 ^{5-1x10 6} клеток (1х10 ⁷ клеток / мл - 2х10 ⁷ клеток / мл).

3. Cell-поверхность окрашивания / Иммунофенотипирование из MDSC использованием проточной цитометрии

1. Этикетка лунки 96-луночного В нижней панели для управления и опытных образцов и одного пятна на компенсацию управления (нет пятен, NS, Mac-1-FITC, Gr-1 БТР и DAPI).
2. Добавить 5x10 ^{5-1x10 6} клеток, эквивалентную 50 мкл / лунку спленоцитов в свои скважины в 96-и V-дно тарелки. Центрифугироватьпластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
3. Подготовить «Мастер Mix" (ММ) Мышь BD Fc Block (Крыса анти-мышиных моноклональных антител CD16/32) разводят в 3% SM, в 1,5 мл микроцентрифужных трубы на льду. В качестве отправной точки используется 1 мкг Fc Блока в 3% СМ для конечного объема 50 мкл, в каждую лунку.
4. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-нижней пластины быстро обращения пластинку снова и обратно, за контейнер для отходов или раковины без разрушения клетки гранулы.
5. Vortex, кратко центрифуги Fc Блок ММ в течение 5 секунд и добавить 50 мкл для всех гранул в 96-и V-дно тарелки. Хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз, оставляя образцы в скважинах. Инкубируйте пластины в течение 15 минут в темноте на льду. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
6. Подготовить «Мастер Mix" (ММ) флуорохромом конъюгированных антител разводят в 3% SM в 1,5 мл трубки микроцентрифужных на льду, в то время как образцы с инкубации Блок Fc. Антитела должна подбиратьсядля определения оптимального разведения для окрашивания процедур. В качестве отправной точки, объединить 1:25 разбавления Mac-1-FITC и 1:20 разбавления Gr-1-APC в 3% СМ для конечного объема 50 мкл, в лунки.
7. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-вниз, как описано выше.
8. Vortex, кратко центрифуги ММ флуоресцентных антител, конъюгированных окрашивания в течение 5 секунд и добавить 50 мкл до контрольной и экспериментальной гранул. Хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Для одного пятна компенсаций, добавить 1:25 разбавления Mac-1-FITC, 1:20 разбавления Gr-1 БТР и 75 нг / мл DAPI, в 3% СМ для конечного объема 50 мкл на лунку их соответствующие лунки. Добавить 50 мл 3% SM к незапятнанным хорошо (нет пятен). Хорошо перемешать и инкубировать клетки в 96-и V-нижнюю пластину в течение 30 минут в темноте на льду.
9. Этикетка FACS труб (5 мл, 12 мм х 75 мм полистирола труб с круглым дном), чтобы соответствовать в каждую лунку в 96-и V-дно тарелки. Добавить 200 мкл 3% SM каждого FACSтрубы.
10. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 минут и удалить супернатантах. Вымойте гранул путем добавления 100 мкл 3% SM каждой гранулы и хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз. Центрифуга пластины при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин. Повторите шаг вымыть еще раз.
11. Осторожно удалите супернатант из каждой скважины из 96-и V-вниз, как описано выше. Ресуспендируйте каждый шарик в 100 мкл 3% СМ и хорошо перемешать.
12. Передача 100 мкл ресуспендировали гранул из каждой лунки 96-и V-нижнюю пластину к их соответственно помечены трубки FACS.
13. До Проточная цитометрия анализ, добавить 75 нг / мл DAPI контролировать и опытных образцов и DAPI одного пятна контроль компенсации.
14. Выполните проточной цитометрии приобретения данных MDSC проценты. Выполните компенсацию с использованием отрицательной (не пятна контроля) и одного положительного контроля. Настройка точки сюжета, который отображает вперед (FSC) в зависимости от стороны рассеяния (SSC) в логарифмической шкале, так что лейкоцитов населенияинтерес может быть идентифицирован. Нарисуйте большой ворот на все лейкоциты, кроме мусора и комков с низким вперед и стороны разбегаются. Из этого родители ворот, создать новый сюжет точки, который отображает SSC против DAPI и ворота на DAPI-(живой) клеток. Выберите этот недавно закрытого населения и создание точки сюжета, который отображает Mac-1 по сравнению с Gr-1 и ворота на двойной положительный (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Магнитное обогащение Gr-1 ⁺ Лейкоциты

1. Алиготе 1x10 ⁷ оставшихся неокрашенных лейкоцитов в соответствующей маркировкой FACS труб и центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин.
2. Подготовить ММ Gr-1-PE антител в 1,5 мл микроцентрифужных трубку. До 10 ⁷ клеток, используют разведение 1:10 Gr-1-PE антитела в 50 мкл Мб, в образце. Для большего количества клеток, расширению объемов соответственно. Кратко центрифуги в течение 5 секунд, добавить в лейкоцитах в трубах FACS и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
3. Добавить 2 мл Мб FACS трубы, центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин и супернатант отказаться.
4. Подготовить ММ Anti-PE микрошариков в 1,5 мл микроцентрифужных трубку. До 10 ⁷ клеток, используют разведение 1:4 анти-PE микрошариков в 200 мкл Мб, в образце. Для большего количества клеток, расширению объемов соответственно. Кратко центрифуги в течение 5 секунд, добавить в лейкоцитах в трубах FACS и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
5. Добавить 2 мл Мб FACS трубы, центрифуги при 12000 оборотов в минуту (250-300 мкг) в течение 5 мин и супернатант отказаться. Ресуспендируют осадок в 3 мл СО. Фильтрация через 70 мкм фильтр в новый, помеченный 50 мл коническую трубку.
6. Подготовка и премьер-Авто MACS Pro сепаратор. Refill все бутылки с соответствующими решениями и пустые бутыли с отходами, в случае необходимости. Включите инструмент и рассмотрим то состояние жидкости контейнеров и столбца (ы) после инициализации. Все символы должны быть зеленого цвета. В меню выберите пункт "Разделение" из верхнегоменю, затем "Промыть Now" из нижнего меню. Выберите "Полоскание" из всплывающего вариант, затем "Выполнить", чтобы начать процесс грунтования. После грунтовки процесс успешно завершен, прибор будет показывать, что он "готов на разделение" по статусу меню.
7. Выберите подходящий охлажденной стойки трубы для труб размеры и место 50 мл коническую трубку с магнитным меченых клеток в строке, 50 мл коническую трубку для отрицательных сбор фракции в строке B и 15 мл коническую трубку для положительных сбор фракции в строке C.
8. Выберите "POSSEL_S" ячейки разделение программы на положительный выбор меченых клеток-мишеней в чувствительный режим образца. Магнитное меченых клеток цель сохраняется в столбце автоматов; немеченого клетки попадают в отрицательную пробирки часть в строке B. На автоматизированных опровержение магнита, меченые клетки-мишени будет выпущен в положительную пробирки в строке C трубки стойку.

5. После сортировки Анализ Gr-1 ⁺ Лейкоциты Обогащенный

1. Пересчет Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- фракции с использованием трипанового синего и hemacytometer. Ресуспендирования клеток в нужной концентрации в 3% окрашивания средних, так что 50 мкл эквивалентно 5x10 ^{5-1x10 6} клеток (1х10 ⁷ клеток / мл - 2х10 ⁷ клеток / мл) и перенести 50 мкл соответственно помечены FACS труб.
2. Подготовить ММ Mac-1 только в разведении 1:25 в 3% СМ для конечного объема 50 мкл на пробу. Пятно клетки и подготовить одного пятна компенсаций Gr-PE, Mac-1 FITC и DAPI для анализа потока цитометрии. Добавить 200 мкл 3% СМ и DAPI жизнеспособность красителя, как описано выше.
3. Выполните проточной цитометрии сбора данных для определения Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- процент и также сравнить MDSC процентов пред-и пост-autoMACS обогащения.

6. Представитель Результаты

Здесь мы показываем, т epresentative результаты autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ лейкоцитов из объединения, наивно селезенки для последующей сортировкой FACS MDSC (рис. 1). 1x10 ⁶ лейкоцитов наивно окрашивали Mac-1-FITC и Gr-1-APC антитела для выявления MDSC процент использования инструмента BD LSRII до сортировки autoMACS. 1x10 ⁷ наивных лейкоцитов затем окрашивали анти-Gr-1-PE антитела и PE-микрошарики для обогащения Gr-1 ⁺ лейкоциты использованием сепаратора autoMACS Pro. После autoMACS обогащения, Gr-1 процент в Gr-1 ⁺ и Гр-1 ^- собрал фракции оценивали с помощью проточной цитометрии. 1x10 ⁶ Гр-1 ⁺ лейкоциты были удалены и окрашивали Mac-1-FITC антител для анализа и сравнения MDSC процент обогащенного объединения наивно лейкоцитов, не обогащенный, объединенный с опухолями лейкоцитов методом проточной цитометрии.

fig1.jpg "/>
Рисунок 1. AutoMACS обогащения Наивные Gr-1 ⁺ лейкоциты для MDSC FACS сортировки. Селезенки были собраны из поджелудочной железы опухоль и наивно мышей и обрабатываются в одной клеточной суспензии. Проточная цитометрия анализу наивный поверхности лейкоцитов окрашиваются Mac-1, Gr-1 люминесцентная конъюгированных антител, до autoMACS обогащения (A). Проточная цитометрия Анализ Gr-1 ⁺ (B) и Gr-1 ^- (C) фракции после autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ клеток от объединения наивно leuckocytes окрашивали Gr-1-PE антитела и анти-PE микрошарики. Проточная цитометрия Анализ MDSC и Gr-1 ⁺ проценты после autoMACS обогащения Gr-1 ⁺ клеток от объединения наивно лейкоцитов (D) по сравнению с не-обогащенного объединенных лейкоцитов из опухоли мышей (E) (наивный мышей, п = 5 , опухоли мышей, п = 3). MDSC и Gr-1 проценты в закрытом представитель участков контура и гистограммы.

Обсуждение

Это подробный метод для обработки и immunophentyping MDSC населения, которые применимы к различным лимфоидной ткани различных животных моделях. В частности, autoMACS обогащения может быть использован для выделения различных групп населения, включая лейкоцитарную Gr-1 истощения спленоцитов ^4, о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
РЕАГЕНТ	КОМПАНИИ	КАТАЛОГ #	КОММЕНТАРИИ
1X фосфатного буфера	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / Mg 2 + / Фенол Красный бесплатно
Альбумин из бычьей сыворотки (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Давайте спокойно раствориться BSA в PBS, стерильная среда
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Тепло инактивированная; стерильной среде
Крыса анти-мышиных моноклональных антител CD16/32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Стерильная среда
Anti-мышь CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	СтерильныйОкружающая среда
Anti-мышь Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Стерильная среда
Anti-мышь Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Стерильная среда
DAPI	Invitrogen	D1306	Последовательные разведения стерильной среде
Клеточная диссоциация сито	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Перед применением автоклава
70-мкм фильтр	BD Biosciences	352350	Стерильная среда
1X лизиса буфер	eBiosciences	00-4333-57	Нагреться до комнатной температуры перед использованием; стерильной среде
Чашки Петри	Fisher Scientific	08-757-12	Стерильная среда
50 мл конческих труб	Thermo Scientific	339652	Стерильная среда
5 мл 12X75mm труб круглого полистирола дно	BD Biosciences	352054	Известный как трубы FACS, стерильная среда
96-и V-днища	Гранулирование	3897	Стерильная среда
Голубой Трипан	CellGro	25-900-ДИ	Стерильная среда
PE микрошарики	Miltenyi Biotec	130-048-801	Стерильная среда
AutoMACS Pro сепаратор	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Столбцы	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS Запуск буфер	Miltenyi Biotec	130-091-221