Preparazione di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) da Naive e Pancreatiche topi affetti da tumore in citometria a flusso e di smistamento automatico magnetico cellulare Attivato (AutoMACS)

Riepilogo

Questo è un metodo rapido e completo di immunofenotipizzazione cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) e arricchimento Gr-1 ⁺ Leucociti dal milza del mouse. Questo metodo utilizza la citometria a flusso e le celle a AutoMACS Ordinamento per arricchire di vitale Gr-1 ⁺ Leucociti prima FACS smistamento di MDSC per uso In vivo E In vitro Saggi.

Abstract

MDSC sono una popolazione eterogenea di macrofagi immature, cellule dendritiche e granulociti che si accumulano negli organi linfoidi in condizioni patologiche tra cui infezioni parassitarie, infiammazioni, stress traumatico, graft-versus-host disease, il diabete e il cancro ^1-7. Nei topi, MDSC express Mac-1 (CD11b) e GR-1 (Ly6G e Ly6C) antigeni di superficie ^7. È importante notare che MDSC sono state ampiamente studiate in vari portatori di tumore host dove vengono notevolmente aumentato e sopprimere le risposte immunitarie anti-tumorali rispetto alle controparti naive ^7-10. Tuttavia, a seconda della condizione patologica, vi sono differenti sottopopolazioni di MDSC con meccanismi distinti e gli obiettivi di soppressione ^11,12. Pertanto, i metodi efficaci per isolare vitali popolazioni MDSC sono importanti nel chiarire loro diversi meccanismi molecolari di soppressione in vitro e in vivo.

Recentemente, il Ghansah gruppo ha riportato l'espansione di MDSC in un modello murino cancro pancreatico. Il nostro portatore di tumore MDSC visualizzare una perdita di omeostasi e di aumento della funzione soppressiva rispetto al ingenua MDSC ^13. MDSC percentuali sono significativamente meno in compartimenti linfoidi di topi naive contro tumore-cuscinetto. Si tratta di un avvertimento importante, che ostacola spesso accurate analisi comparativa di questi MDSC. Pertanto, arricchendo Gr-1 ⁺ leucociti dai topi naive prima Fluorescence activated cell sorting (FACS) esalta la purezza, la vitalità e riduce significativamente il tempo di ordinamento. Tuttavia, l'arricchimento del Gr-1 ⁺ leucociti da topi affetti da tumore è facoltativo in quanto questi sono in abbondanza per FACS veloci ordinamento. Pertanto, in questo protocollo, si descrive un metodo molto efficiente di immunofenotipizzazione MDSC e arricchire Gr-1 ⁺ leucociti da milze di topi naive per l'ordinamento MDSC in modo tempestivo. Immunocompetenti topi C57BL / 6 vengono inoculate con murino Panc02 ceLLS per via sottocutanea mentre i topi naïve ricevere 1XPBS. Circa 30 giorni dopo l'inoculazione, milza vengono raccolti e trasformati in cella singola sospensioni utilizzando una cella di dissociazione setaccio. Splenociti sono poi globuli rossi (RBC) lisati e un'aliquota di questi leucociti sono testate in base fluorocromo-coniugati anticorpi contro Mac-1 e Gr-1 a percentuali immunofenotipo MDSC citometria a flusso. In un esperimento parallelo, leucociti interi da topi naive sono macchiati coniugate con quelle fluorescenti-Gr-1 incubate con anticorpi, PE-microsfere e positivamente selezionato utilizzando un sistema automatizzato di smistamento magnetico cellulare Attivato (autoMACS) Pro Separator. Successivamente, una aliquota di GR-1 ⁺ leucociti vengono colorate con anticorpi Mac-1 per identificare l'aumento percentuale MDSC citometria a flusso. Ora, queste GR1 ⁺ leucociti arricchiti sono pronti per FACS cernita di MDSC da utilizzare in analisi comparative (naïve vs portatore di tumore) in vivo e in vitro

Protocollo

Prima di iniziare, preparare le seguenti soluzioni:

3% colorazione Media (SM):

-3% Siero fetale bovino (FBS) in 1X tampone fosfato salino (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% di albumina da siero bovino (BSA) in 1XPBS

1. Harvest milza di topi

1. Iniettare per via sottocutanea 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi (Harlan) con 1,5 x 10 ⁵ cellule murine Panc02 sospesi in 100 microlitri di PBS 1x (portatore di tumore, TB). Topi di controllo (Naïve) ricevono 100 1XPBS pl.
2. Circa 4 settimane dopo l'iniezione, i topi eutanasia per asfissia di anidride carbonica.
3. Harvest milza di topi per via smussa con pinze e forbici, quindi pesare con una bilancia. Luogo in separata milza, etichettato provette da 50 ml coniche contenenti 1 x PBS.

2. Generare una cella singola Suspension dei leucociti da milze

Tutte le operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile sotto una cappa di protezione biologica e le cellule e gli anticorpi tenuti su ghiaccio.

1. Montare la dissociazione cellulare setaccio inserendo lo schermo maglia nell'apertura del bicchiere verso il basso. Quindi, inserire l 'anello nella zona filettata con il lato scanalato e utilizzare il key ring per stringere l'anello di sostegno, tenendo così lo schermo in posizione. Posizionare il setaccio montato in una piastra Petri 10 ml contenente 1 x PBS.
2. Milza piscina e pestello in vetro uso per macinare milza contro lo schermo maglie della cellula setaccio dissociazione e nella piastra di Petri. Ripetere l'operazione per ciascun gruppo di trattamento di topi.
3. Sospensione cellulare filtro in una provetta da 50 ml con un colino cella 70 micron e una pipetta da 5 ml sierologica. Centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 5 ml 1 x tampone di lisi per RBC milza. Pipettare su e giù con forza. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Arrestare la reazione aggiungendo 20 ml di 1 x PBS. Pipettare su e giù con forza. Centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
5. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 20 ml 1 x PBS sterile. Pipettare su e giù con forza.
6. Contare le cellule con tripan blu e un emocitometro e risospendere alla concentrazione desiderata in 3% SM in modo che 50 pl è equivalente a 5x10 ^{5-1x10 6} cellule (1x10 ⁷ cellule / ml - 2x10 ⁷ cellule / ml).

3. Cell-superficie colorazione / Immunofenotipizzazione MDSC della citometria a flusso

1. Etichettare i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti fondo a V per il controllo e campioni sperimentali e macchie singole per i controlli di compensazione (No Stain, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC e DAPI).
2. Aggiungere 5x10 ^{5-1x10 6} cellule equivalenti a 50 pl / pozzetto di splenociti ai relativi pozzetti in 96-ben-V piastra inferiore. CentrifugaPiastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
3. Preparare "Mix Master" (MM) di Mouse BD Fc Block (Rat anti-topo CD16/32 anticorpo monoclonale) diluito in 3% SM, in una provetta 1,5 ml su ghiaccio. Come punto di partenza, utilizzare 1 Block ug Fc in 3% SM per un volume finale di 50 pl, per pozzetto.
4. Rimuovere con cautela il surnatante da ogni pozzetto del 96 e V-bottom piastra invertendo rapidamente la piastra sopra e ritorno, su un contenitore per rifiuti o nel lavandino, senza interruzione dei pellet cellulari.
5. Vortex, centrifugare brevemente MM Block Fc per 5 secondi e aggiungere 50 microlitri a tutti i pellets in ben 96 V-piastra inferiore. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù, lasciando i campioni nei pozzetti. Incubare la piastra per 15 minuti al buio su ghiaccio. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
6. Preparare "Mix Master" (MM) di anticorpi coniugati con fluorocromo diluito in 3% SM in una provetta 1,5 ml su ghiaccio, mentre i campioni incubare con blocco Fc. Gli anticorpi devono essere titolatodeterminare diluizioni ottimali per procedure di colorazione. Come punto di partenza, combinare una diluizione 1:25 di Mac-1-FITC e 1:20 diluizione di Gr-1-APC in 3% SM per un volume finale di 50 pl, per pozzetto.
7. Rimuovere attentamente surnatante da ciascun pozzetto della ben-96 V-basso come precedentemente descritto.
8. Vortex, centrifugare brevemente MM di fluorescenza anticorpi coniugati colorazione per 5 secondi e aggiungere 50 microlitri di controllo e pellets sperimentali. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Per singola macchia compensazioni, aggiungere una diluizione 1:25 di Mac-1-FITC, 1:20 diluizione di Gr-1-APC e 75 ng / ml di DAPI, 3% in SM per un volume finale di 50 pl per pozzetto a relativi pozzetti. Aggiungere 50 microlitri SM 3% senza macchia e (senza macchia). Mescolare bene e incubare cellule in ben 96 V-piastra inferiore per 30 minuti al buio in ghiaccio.
9. FACS Etichettare provette (5 ml, 12 mm x 75 mm provette di polistirene a fondo tondo) per corrispondere a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti V-basso. Aggiungere 200 ul SM 3% ad ogni FACStubo.
10. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti e rimuovere supernatanti. Lavare pellet aggiungendo 100 microlitri SM 3% ad ogni pellet e mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.
11. Rimuovere attentamente surnatante da ciascun pozzetto della ben-96 V-basso come precedentemente descritto. Risospendere ogni pellet in 100 SM ul 3% e mescolare bene.
12. Trasferire 100 pl pellet risospeso da ciascun pozzetto della 96-ben-V piastra inferiore alla loro tubo rispettivamente etichettati FACS.
13. Prima analisi del flusso di citometria, aggiungere 75 ng / ml DAPI per il controllo e campioni sperimentali e di controllo DAPI singola macchia di compensazione.
14. Eseguire flusso di acquisizione di dati di citometria percentuali MDSC. Eseguire la compensazione utilizzando il negativo (nessun controllo macchia) e dei controlli singoli positivi. Impostare un dot plot che visualizza il forward scatter (FSC) rispetto a lato (SSC) in scala logaritmica, in modo che le popolazioni di leucocitiinteresse possono essere identificati. Disegnare un grande cancello su tutti i leucociti, ad eccezione detriti e macchie con il più basso in avanti e scatter laterale. Da questa porta principale, creare un nuovo grafico che visualizza dot SSC contro DAPI e cancello il DAPI-(live) delle cellule. Selezionare questa popolazione di recente gated e creare un dot plot che visualizza Mac-1 contro Gr-1 e porta sul doppio positive (Mac-1 ⁺ Gr-1 ⁺⁾ MDSC.

4. Arricchimento magnetica del GR-1 ⁺ Leucociti

1. Aliquote 1x10 ⁷ leucociti rimanenti non colorati in tubi opportunamente etichettati FACS e centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
2. Preparare MM di Gr-1-PE anticorpo in una provetta da 1,5 ml. Per un massimo di 10 ⁷ celle, utilizzare una diluizione 1:10 del Gr-1-PE anticorpi in 50 MB pl, per campione. Per il numero di cellule più grandi, scalare i volumi di conseguenza. Brevemente centrifugare per 5 secondi, aggiungere a leucociti in tubi FACS e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
3. Aggiungere 2 ml di MB ai tubi FACS, centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Preparare MM di Anti-PE microsfere in una provetta 1,5 ml. Per un massimo di 10 ⁷ celle, utilizzare una diluizione 1:04 di anti-PE microsfere in 200 MB pl, per campione. Per il numero di cellule più grandi, scalare i volumi di conseguenza. Brevemente centrifugare per 5 secondi, aggiungere a leucociti in tubi FACS e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
5. Aggiungere 2 ml di MB ai tubi FACS, centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 3 ml di SB. Filtrare attraverso un colino 70 micron in un nuovo, etichettato tubo da 50 ml.
6. Preparare e prime Auto MACS Separator Pro. Refill tutte le bottiglie con le soluzioni più appropriate e svuotare la bottiglia dei rifiuti, se necessario. Accendere strumento ed esaminare lo stato dei contenitori di liquidi e di colonna (s) dopo l'inizializzazione. Tutti i simboli dovrebbero essere di colore verde. Nel menu, selezionare "separazione" dal superiorebarra dei menu seguito da "Wash Now" dalla barra dei menu inferiore. Selezionare "Risciacquare" dal pop-up opzione seguito da "Run" per avviare il processo di adescamento. Una volta che il processo di adescamento è completata con successo, lo strumento visualizzerà quindi che si tratta di "Ready for Separation" sotto il menu Stato.
7. Scegli adatto a cremagliera refrigerate tubo per dimensioni dei tubi e il luogo tubo da 50 ml con le cellule marcate magneticamente nella riga A, tubo da 50 ml conica per la raccolta frazione negativa nella riga B e 15 ml tubo conico per la raccolta delle frazioni positive in fila C.
8. Scegliere il programma di separazione "POSSEL_S" cellula per la selezione positiva delle cellule bersaglio etichettati in modo sensibile dai campioni. Cellule bersaglio marcate magneticamente sono trattenuti sulla colonna tavole; cellule non marcate vengono rilasciati nel tubo di raccolta delle frazioni negativo in fila B. In retrazione automatica del magnete, le cellule bersaglio marcate verrà rilasciato nel tubo di raccolta positiva in fila C del tubo rack.

5. Post-Sort Analisi dei GR-1 ⁺ Leucociti arricchite

1. Recount Gr-1 ⁺ e Gr-1 ^- frazioni utilizzando trypan blu e un emocitometro. Risospendere le cellule a concentrazione desiderata nel mezzo colorazione 3% in modo che 50 pl è equivalente a 5x10 ^{5-1x10 6} cellule (1x10 ⁷ cellule / ml - 2x10 ⁷ cellule / ml) e 50 pl per trasferire corrispondentemente etichettati tubi FACS.
2. Preparare una MM di Mac-1 solo, a una diluizione 1:25 a 3% SM per un volume finale di 50 pl per campione. Colorare le cellule e preparare singole compensazioni macchia di Gr-PE, Mac-1 FITC e DAPI per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere 200 pl SM 3% e colorante vitalità DAPI come precedentemente descritto.
3. Eseguire la citometria a flusso di acquisizione dati per determinare Gr-1 ⁺ e Gr-1 ^- percentuali e di confrontare anche le percentuali di arricchimento MDSC pre-e post-autoMACS.

6. Risultati rappresentativi

Qui vi mostriamo r Risultati epresentative per l'arricchimento autoMACS di Gr-1 ⁺ leucociti dal pool, milza naïve per FACS successive di smistamento di MDSC (Figura 1). 1x10 ⁶ leucociti naive sono state colorate con Mac-1-FITC e Gr-1-APC anticorpi per identificare percentuali MDSC con uno strumento BD LSRII, prima di smistamento autoMACS. 1x10 ⁷ leucociti naive sono state poi colorate con anticorpi anti-Gr-1-PE PE-anticorpi e microsfere per l'arricchimento del Gr-1 ⁺ leucociti utilizzando un separatore autoMACS Pro. Post-autoMACS arricchimento, Gr-1 percentuali in Gr-1 ⁺ e Gr-1 ^- frazioni raccolte sono state valutate mediante citometria a flusso. 1x10 ⁶ Gr-1 ⁺ leucociti sono stati rimossi e colorati con Mac-1-FITC anticorpi per analizzare e confrontare le percentuali di MDSC arricchito, naive agli aggregati leucociti non arricchito, pool portatori di tumore leucociti mediante citometria a flusso.

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Figura 1. Arricchimento AutoMACS di ingenuo Gr-1 ⁺ leucociti per FACS MDSC Ordinamento. Milze sono state raccolte dai topi portatori di tumore del pancreas e ingenuo e trasformati in unicellulari sospensioni. L'analisi di citometria a flusso superficiale ingenuo leucociti colorati con Mac-1 e GR-1 fluorescente anticorpi coniugati, prima di arricchimento autoMACS (A). Analisi di citometria a flusso di Gr-1 ⁺ (B) e GR-1 ^- (C) frazioni post-autoMACS arricchimento di Gr-1 ⁺ cellule provenienti da un pool leuckocytes naïve colorati con Gr-1-PE e anticorpi anti-PE microsfere. Analisi di citometria a flusso di MDSC e Gr-1 ⁺ percentuali di post-autoMACS arricchimento di Gr-1 ⁺ cellule provenienti da un pool leucociti naïve (D) rispetto ai non-arricchiti leucociti raccolti da topi affetti da tumore (E) (topi naïve, n = 5 ; topi portatori di tumore, n = 3). MDSC e GR-1 percentuali sono gated nei grafici di contorno rappresentative e istogrammi.

Discussione

Questo è un metodo dettagliato per l'elaborazione e la immunophentyping popolazioni MDSC che è applicabile a diversi tessuti linfoidi provenienti da vari modelli animali. In particolare, l'arricchimento autoMACS può essere usato per l'isolamento delle varie popolazioni di leucociti cui Gr-1 deplezione di splenociti ^4, purificazione di sottoinsiemi mieloidi da splenociti e linfonodi ^5, l'isolamento dei neutrofili midollo osseo ¹⁴ e la purificazione di cellule T CD8

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REATTIVO	AZIENDA	Catalogo #	COMMENTI
1X Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific Hyclone	SH30028.02	Ca 2 + / 2 + Mg / rosso fenolo-free
Albumina da siero bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Lasciate sciogliere indisturbati BSA in PBS; ambiente sterile
Siero bovino fetale (FBS)	Thermo Scientific Hyclone	SV3001403HI	Inattivato calore; ambiente sterile
Rat anti-topo CD16/32 anticorpo monoclonale (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Ambiente sterile
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC	eBiosciences	11-0112	SterileAmbiente
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC	eBiosciences	17-5931	Ambiente sterile
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE	eBiosciences	12-5931	Ambiente sterile
DAPI	Invitrogen	D1306	Diluizione Ambiente Serial Sterile
Dissociazione cellulare Sieve	Sigma-Aldrich	CD1-1KT	Autoclave prima dell'uso
70-um filtro	BD Biosciences	352350	Ambiente sterile
1X RBC Lysis Buffer	eBiosciences	00-4333-57	Calda a temperatura ambiente prima dell'uso; ambiente sterile
Scatole Petri	Fisher Scientific	08-757-12	Ambiente sterile
50ml coniCal tubi	Thermo Scientific	339652	Ambiente sterile
5ml 12X75mm polistirene con fondo arrotondato tubi	BD Biosciences	352054	Conosciuto come tubi FACS; ambiente sterile
96 pozzetti V-piastre di fondo	Corning	3897	Ambiente sterile
Trypan blu	Cellgro	25-900-CI	Ambiente sterile
PE microsfere	Miltenyi Biotec	130-048-801	Ambiente sterile
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
AutoMACS Colonne	Miltenyi Biotec	130-021-101
AutoMACS tampone di corsa	Miltenyi Biotec	130-091-221