Жидкая фаза Affinity Capture методом с использованием магнитных шариков по изучению белок-белковые взаимодействия: Полиовирус-нанотела Пример

Резюме

В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. Это надежный метод, основанный на взаимодействии магнитных шариков и меченных белков (например, нанотел), с одной стороны, и близость между помеченные белка, а второй, обозначенный белка (например, вирус полиомиелита), с другой.

Аннотация

В этой статье, простой, количественный, жидкая фаза близости захвата анализа представлены. При условии, что один белок может быть помечен и другой белок надписью, этот метод может быть реализован для изучения белок-белковых взаимодействий. Она основана, с одной стороны на признание меченых белков кобальта покрытием магнитных шариков, а с другой стороны по взаимодействию помеченные белка, а второй специфического белка, который маркирован. Во-первых, маркировку и меченных белков перемешивают и выдерживают при комнатной температуре. Магнитные шарики, которые признают тегов, добавляются и связанной фракции меченых белков отделяют от несвязанного фракция с помощью магнитов. Количество меченых белков, которые захватили можно определить косвенным образом путем измерения сигналов меченых белков остается в несвязанной фракции. Описанные жидкой фазы близости анализ чрезвычайно полезен, когда конформационные преобразования чувствительные белки задницуАйед. Разработки и применения анализа показано, для взаимодействия между полиовируса и полиовируса признании нанотел ^1. С полиовируса чувствительны к конформационным конвертации ² при подключении к твердой поверхности (неопубликованные результаты), использование ИФА ограничены и жидкой фазы на основе системы должно быть предпочтительным. Например жидкой фазы система часто используется в polioresearch ^3,4 является микро белка-иммунопреципитации тест ^5. Хотя этот тест доказал свою применимость, он требует Fc-структура, которая отсутствует в нанотел ^6,7. Однако, как еще одна возможность, это интересные и стабильные однодоменных антител ⁸ может быть легко разработаны с различными тегами. Широко используется (Его) _6-тег показывает сродство к двухвалентных ионов, таких как никель или кобальт, который может на свою очередь, легко нанесенные на магнитные шарики. Поэтому мы разработали этот простой количественныйАнализ близость захвата на основе кобальта покрытием магнитных шариков. Полиовирус был помечен ³⁵ S чтобы беспрепятственного взаимодействия с нанотел и сделать количественное определение возможно. Метод прост в исполнении и могут быть установлены с низкой стоимостью, которая также поддерживается возможность эффективно регенерации магнитных шариков.

протокол

Принцип (А) и обзор метода (б) изображены на рисунке 1.

1. Подготовка буфера

1. Подготовить Связывание / Wash буфера путем растворения натрия дигидрофосфат (50 мм) и хлорид натрия (300 ммоль) в воде и доведения рН до 8,0. Кроме того, добавляют твин-20 (0.01% (т / х) конечная концентрация), метионин (2% (т / х) конечная концентрация) и альбумин (0,1% (м / о) конечная концентрация) и приспособиться к необходимого объема.

2. Подготовка магнитных шариков

Подготовка магнитных шариков в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Кратко:

1. Ресуспендируют магнитных шариков помощью вихря.
2. Передача, для каждого образца, 10 мкл ресуспендированного магнитных шариков (40 мг / мл) в трубе.
3. Сбор магнитных шариков с помощью магнита, пока не ясно супернатант (+ / - 30 сек) и удалите супернатант тщательно.
4. Вымойтемагнитных шариков в два раза: ресуспендирования бусины в 150 мкл связывания / Wash буфера. Миграция магнитные шарики с одной стороны трубки с помощью магнита, пока супернатанте ясно и осторожно удалите супернатант.
5. Используйте 40 мкл связывания / Wash буфера для каждого образца, для ресуспендирования бисером (10 мг / мл).

3. Affinity Capture Пробирной

Примечание: Для измерения (космические) фон радиоактивности (0% радиоактивности), не меченые вируса добавляется в контрольном образце 1. Вместо этого, тот же объем связывания / Wash буфер добавляется.

Примечание: 100% радиоактивности определяется 2 контрольных образца, к которому все компоненты добавляются только нанотела. Вместо этого, тот же объем связывания / Wash буфер добавляется.

1. Принесите 2000 копий в минуту ³⁵ S помечены (β-излучения) полиовируса Сэбина штамм типа 1, ^9, разбавляют связывания / Wash буфера 80 мкл в 96-луночных планшет.
2. Добавить 10-мщ л нанотела разведения в лунках.
3. Смешать в течение 10 секунд с помощью шейкера.
4. Позвольте образцов для инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре.
5. Добавить 40 мкл промытый магнитном подвесе бисер и инкубировать 10 минут при комнатной температуре, при постоянно дрожать.
6. Отделите бисером и супернатант с помощью магнита и передачи очищенного супернатант в трубку.

4. Измерение радиоактивности

1. Трансфер 50 мкл надосадочной с шагом 3,6 в подсчете колбу.
2. Добавьте 3 мл жидкости сцинтилляционных и перемешать. Измерение радиоактивности в β-сцинтилляционных счетчиков.

5. Утилизация бисера

1. Соберите использовать магнитные шарики в трубу и центрифуги в 500 мкг в течение 2 минут или пока не ясно супернатант получается.
2. Удалить супернатант и ресуспендируют бусы в 6 мл 0,5 М NaOH.
3. Передача подвески multiplэлектронных ламп и инкубировать в ультразвуковой ванне в течение 5 минут.
4. Использование магнитов для сбора магнитных шариков и удалите супернатант.
5. Добавить 1 мл 2% SDS-решение в каждую пробирку и ресуспендируют помощью вихря. Кипятить в течение 5 минут.
6. Собирайте шарики и удалите супернатант. Ресуспендируют бусины в 1 мл 0,2 М ЭДТА (рН = 7).
7. Инкубировать пробирки в ультразвуковой ванне в течение 5 минут и еще раз, удалите супернатант.
8. Добавить 1 мл воды на каждую трубу и ресуспендируют бисера. Собирайте шарики и удалите супернатант. Повторите этот шаг мыть два раза.
9. Удалить супернатант и ресуспендируют бусины в 1 мл 10 мМ CoCl ₂ решения. Положите на шейкере в течение 10 минут.
10. Удаляют супернатант с помощью магнита, чтобы собрать шарики и ресуспендируют в 1 мл связывание / Wash буфера.
11. Удалить супернатант и мыть бусин в два раза с использованием 1 мл 20% (объем / объем) этанол
12. Ресуспендируют бусины в их первоначальном объеме 20% (объем / объем) и др.hanol для получения регенерированного бусины в концентрации 40 мг / мл.

6. Интерпретация результатов

1. Контрольный образец 1, в котором не меченые вирус был добавлен, будет использоваться для коррекции фона радиоактивности и установить 0% радиоактивности значение. Контрольный образец 2, который не содержит нано и где, следовательно, все меченые вирус остается в супернатанте, устанавливается в качестве 100% радиоактивности значение.
2. Процент радиоактивности в супернатант (=%) является мерой общей осадки (= 100 -%) из радиоактивно вируса нано.

7. Представитель Результаты

Представитель результаты этого анализа захвата близость показаны на рисунках 2, 3 и 4. На рисунке 2, близость PVSS38C, конкретные нанотела для полиовируса, показано. Близость PVSS38C был протестирован на трех различных антигенов poliovIrus: Native-антиген (N-антигена), Подогрев-антиген (Н-антиген) и 14S субъединиц. N-антигена целый вирус, который является заразным. Когда вирус нагревается (20 минут при 56 ° C) или присоединяется к твердой поверхности (неопубликованные результаты), конформации капсида изменения, в результате чего (частичной) потере вирусной РНК и белок капсида VP4 и пустой капсид формируется, которые тогда называли Н-антигены. 14S субъединицы сборки промежуточных продуктов. Эти антигены распознаются различные наборы антител после иммунизации ¹⁰ и имеют, соответственно, разные эпитопы и антигенные сайты. На рисунке процент радиоактивности обнаружено в надосадочной представлены в зависимости от концентрации нано. Видно, что радиоактивность в супернатанте образцов, содержащих меченые 14S субъединиц уменьшается с увеличением концентрации нано PVSS38C. Это можно перевести как увеличение количества полиовируса 14S субъединиц конподключенного к нанотела PVSS38C и косвенно магнитных шариков. Захват титр (= концентрация нанотела необходимо захватить 50% радиоактивно вирус) может быть рассчитана как графически 0,099 нм. Нет близости PVSS38C для N-антигенных и Н-антигенной форму полиовируса не наблюдается. Из этих данных интерпретируется что PVSS38C взаимодействует с эпитопом, что является исключительно присутствующих на 14S субъединицу, а не на две другие формы антигенного полиовируса.

Чтобы продемонстрировать, что потеря радиоактивности супернатанта только благодаря специфическим сродством к нанотела его антигенов, тот же тест был выполнен с Nb1, нанотела порожденных против lrpB транскрипционный регулятор Sulfolobus sulfataricus и известно, что нет взаимодействия с любой антиген полиовируса. В результате этого анализа показано на рисунке 3. Все меченые вирус остается в супернатантах показывает, что нет реактивностьNb1 против трех антигенных формах полиомиелита.

Воспроизводимость результатов была проверена путем повторения эксперимента в общей сложности восемь раз для одного данного нанотела (т.е. PVSP29F) в разные дни и разные лица. Полученные результаты представлены на рисунке 4. Среднее значение процентных радиоактивности в супернатант рассчитывается для каждой концентрации нано и представлена ​​в соответствии с ее стандартным отклонением.

Рисунок 1. Обзор принципу (А) и метода (б) анализа. А. Его с метками нанотел, специально признать определенные антигены полиовируса смогут взаимодействовать с кобальтом покрытием магнитных шариков и ускорить радиоактивно меченый вирус. B. Его с метками нанотел добавляются радиоактивно меченых полиовируса и инкубировать. Кобальт-покрытием магнитных шариковдобавлены и магнитной сепарации связанного / несвязанного антигена производится. Радиоактивности супернатанта измеряется и количество захваченных антиген может быть получен.

Рисунок 2. Магнитные близость бисером захвата различных антигенов полиовируса нанотела PVSS38C. Процент радиоактивности обнаружено в надосадочной представлена ​​как функция концентрации PVSS38C. Для 14S концентрация-эффект может быть найден, показывает взаимодействие с PVSS38C эпитоп только присутствовать на 14S. Нет значимого взаимодействия с N-, ни Н-антиген может быть обнаружен, хотя и незначительный неспецифический захватив при очень высоких концентрациях заметил.

Рисунок 3. Магнитные близость бисером захвата различных антигенов полиовируса нанотела Nb1 . Процент радиоактивности обнаружено в надосадочной представлена ​​как функция концентрации Nb1. Nb1, как известно, не взаимодействует с любой полиовирус-антиген или-субъединиц. Так как 100% радиоактивности обнаружено в надосадочной, вирус не был, не привязанные к Nb1. Потеря радиоактивности на рисунке 2, следовательно, только в связи с специфическим сродством к нанотела его антигенов.

Рисунок 4. Воспроизводимость анализа. Среднее значение процентных радиоактивности в надосадочной представлены в зависимости от концентрации нано. Эксперимент был повторен в восемь раз в разные дни и разные лица. Стандартное отклонение представляется как вертикальные полосы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В протоколе, радиоактивность антиген взаимодействует с нанотела определяется как потеря радиоактивно вируса супернатант. Таким образом, количество осажденного радиоактивности (= 100 -%) (привязанный к магнитные шарики) можно оценить косвенным образом на радиоактивность в супернатанте (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads Его-тегов Выделение и Pulldown	Invitrogen	101.03D	Магнитные гранулы
'HiSafe "Optiphase 2	Perkin Elmer	1200 - 436	Сцинтилляционные жидкости