Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

Riepilogo

In questo articolo, un semplice, quantitativa, liquido affinità saggio fase di cattura è presentato. Si tratta di una tecnica affidabile basato sull'interazione fra perline magnetiche e proteine ​​etichetta (ad esempio nanobodies) da un lato e l'affinità tra la proteina marcata ed una seconda, proteina marcata (poliovirus esempio) dall'altro.

Abstract

In questo articolo, un semplice, quantitativa, liquido affinità saggio fase di cattura è presentato. A condizione che una proteina può essere etichettato e un'altra proteina etichettatura, questo metodo può essere implementato per l'istruttoria delle interazioni proteina-proteina. Esso si basa su un lato sul riconoscimento della proteina marcata con cobalto perline rivestite magnetiche e dall'altro sulla interazione tra la proteina marcata e una seconda proteina specifica che viene etichettato. In primo luogo, le proteine ​​marcate e targhetta vengono miscelati e incubati a temperatura ambiente. Le biglie magnetiche, che riconoscono il comando, vengono aggiunti e la frazione legata di proteina marcata viene separata dalla frazione non legata utilizzando magneti. La quantità di proteina marcata che viene catturata può essere determinato in modo indiretto misurando il segnale della proteina marcata è rimasto nella frazione non legata. La fase di test descritto liquida affinità è estremamente utile quando le proteine ​​di conversione conformazionale sensibili sono assAyed. Lo sviluppo e l'applicazione del test è stata dimostrata per l'interazione tra poliovirus e poliovirus riconoscere nanobodies ^1. Poiché poliovirus è sensibile alla conversione conformazionale ² quando attaccato ad una superficie solida (risultati non pubblicati), l'uso di ELISA è limitato e un sistema di fase liquida a base deve pertanto essere preferito. Un esempio di un sistema di fase liquida a base spesso utilizzati in polioresearch ^3,4 è la proteina A micro-immunoprecipitazione test ^5. Anche se questo test ha dimostrato la sua applicabilità, esso richiede una struttura-Fc, che è assente nelle nanobodies ^6,7. Tuttavia, come un'altra opportunità, questi interessanti e stabile singolo dominio anticorpi ⁸ può essere facilmente costruito con diversi tag. Il ampiamente utilizzato (His) _6-tag mostra affinità per ioni bivalenti come nichel o cobalto, che possono a loro volta essere facilmente rivestita su biglie magnetiche. Abbiamo quindi sviluppato questo quantitativo semplicecattura saggio di affinità a base di cobalto perline rivestite magnetiche. Poliovirus è stato marcato con ³⁵ S per consentire l'interazione con i nanobodies senza ostacoli e fare una rilevazione quantitativa fattibile. Il metodo è di facile esecuzione e può essere stabilita con un basso costo, che è ulteriormente supportata dalla possibilità di rigenerare efficacemente le biglie magnetiche.

Protocollo

Il principio (A) e una panoramica del metodo (B) sono rappresentati nella Figura 1.

1. Preparazione del tampone

1. Preparare Binding / tampone di lavaggio sciogliendo sodio diidrogeno fosfato (50 mM) e cloruro di sodio (300 mM) in acqua e regolare il pH a 8,0. Inoltre aggiungere Tween 20 (0,01% (m / v) concentrazione finale), metionina (2% (m / v) concentrazione finale) e albumina (0,1% (m / v), concentrazione finale) e regolare il volume desiderato.

2. Preparazione delle biglie magnetiche

Preparare le biglie magnetiche in base al manuale di istruzioni. In breve:

1. Risospendere le biglie magnetiche utilizzando un vortice.
2. Trasferimento, per ciascun campione, 10 microlitri delle microsfere in sospensione magnetiche (40 mg / ml) in una provetta.
3. Raccogliere le biglie magnetiche con un magnete, finché il surnatante è chiaro (+ / - 30 sec) e rimuovere il supernatante attentamente.
4. Lavare ilbiglie magnetiche due volte: risospendere le sfere in 150 microlitri di Binding / tampone di lavaggio. Migrazione le biglie magnetiche ad un lato del tubo utilizzando un magnete finché il surnatante è chiara e rimuovere il supernatante.
5. Uso 40 microlitri di Binding / tampone di lavaggio, per ciascun campione, per risospendere le sfere (10 mg / ml).

3. Affinity Capture Assay

Nota: Per misurare il (cosmica) radioattività di fondo (0% della radioattività), nessun virus radiomarcato viene aggiunto a un campione di controllo 1. Invece, lo stesso volume Binding / lavaggio tampone viene aggiunto.

Nota: 100% radioattività è definita da un 2 campione di controllo a cui vengono aggiunti tutti i componenti eccetto il nanobody. Invece, lo stesso volume Binding / lavaggio tampone viene aggiunto.

1. Portare 2000 cpm di ³⁵ S etichettati (β-radiazioni) poliovirus di tipo Sabin ceppo 1 ^9, diluito con Binding / Wash buffer per 80 microlitri in una piastra a 96 pozzetti microtiter.
2. Aggiungere 10 & mu; l di diluizione nanobody ai pozzetti.
3. Mescolare per circa 10 secondi con un agitatore.
4. Permettere ai campioni di incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 40 microlitri della sospensione magnetica lavato perline e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, sotto continua agitazione.
6. Separate le perline e il supernatante utilizzando un magnete e trasferire il surnatante eliminato in un tubo.

4. Misurazione della radioattività

1. Trasferire 50 pl del supernatante dal passaggio 3,6 in un pallone di conteggio.
2. Aggiungere 3 ml di liquido di scintillazione e mescolare. Misurare la radioattività in un contatore a scintillazione-β.

5. Riciclaggio i Beads

1. Raccogliere le perline magnetiche usate in una provetta e centrifugare a 500 xg per 2 minuti o fino a un surnatante limpido.
2. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 6 ml 0.5 M NaOH.
3. Trasferire la sospensione multipltubi elettronici ed incubare in un bagno ad ultrasuoni per 5 minuti.
4. Utilizzare i magneti per raccogliere le biglie magnetiche e rimuovere il supernatante.
5. Aggiungere 1 ml di 2% SDS-soluzione a ciascuna provetta e utilizzando un vortice. Far bollire per 5 minuti.
6. Raccogliere le perline e rimuovere il supernatante. Risospendere le sfere in 1 ml di 0,2 M EDTA (pH = 7).
7. Incubare le provette in un bagno ad ultrasuoni per 5 minuti e ancora una volta, rimuovere il supernatante.
8. Aggiungere 1 ml di acqua a ciascuna provetta e le microsfere. Raccogliere le perline e rimuovere il supernatante. Ripetere questa fase di lavaggio due volte.
9. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 1 ml di 10 mM CoCl ₂ soluzione. Mettere su un agitatore per 10 minuti.
10. Rimuovere il surnatante usando un magnete per raccogliere le perline e risospendere in 1 ml di Binding / tampone di lavaggio.
11. Rimuovere il surnatante e lavare le perline due volte con 1 ml di 20% (v / v) etanolo
12. Risospendere le sfere nel loro volume originale del 20% (v / v) ethanol ottenere perle rigenerate in una concentrazione di 40 mg / ml.

6. Interpretazione dei risultati

1. Campione di controllo 1, in cui è stato aggiunto nessun virus radiomarcato, verrà usato per correggere la radioattività di fondo e per impostare il valore di radioattività 0%. Campione di controllo 2, che non contiene nanobody e dove di conseguenza tutti i virus radiomarcato rimane nel surnatante, viene impostato come valore radioattività 100%.
2. La percentuale di radioattività nel supernatante (= uno%) è una misura della precipitazione complessiva (= 100 - uno%) del virus dal radiomarcato nanobody.

7. Risultati rappresentativi

Risultati rappresentativi per questo saggio di cattura affinità sono mostrate nelle Figure 2, 3 e 4. In figura 2, l'affinità di PVSS38C, uno specifico per nanobody poliovirus, viene mostrato. L'affinità di PVSS38C è stato testato per tre differenti antigeni di poliovIRU: Native-antigene (antigene N), Piscina riscaldata-antigene (antigene H) e la subunità 14S. N-antigene è il virus intatto, che è contagioso. Quando il virus viene riscaldata (20 minuti a 56 ° C) o attaccato ad una superficie solida (risultati non pubblicati), la conformazione dei cambiamenti del capside, risultando in un (parziale) perdita di RNA virale e la proteina del capside VP4, e vuoti capsidi sono formate che sono poi chiamati H-antigeni. Subunità 14S sono intermedi di montaggio. Questi antigeni sono riconosciuti da diversi set di anticorpi dopo immunizzazione ¹⁰ e quindi possiedono epitopi differenti e siti antigenici. Nella figura la percentuale di radioattività trovato nel supernatante è rappresentata come una funzione della concentrazione di nanobody. Si può vedere che la radioattività nel supernatante dei campioni contenenti radiomarcati subunità 14S diminuisce con concentrazioni crescenti del PVSS38C nanobody. Questo può essere tradotto come un aumento nella quantità di poliovirus con subunità 14Scollegato alla PVSS38C nanobody e, indirettamente, alle biglie magnetiche. Il titolo cattura (= concentrazione di nanobody necessario acquisire 50% di virus radiomarcato) può essere calcolato come graficamente 0,099 nM. No affinità PVSS38C per la N-antigenica e H-antigenica forma di poliovirus si osserva. Da questi dati viene interpretato PVSS38C che interagisce con un epitopo che è presente esclusivamente sulla subunità 14S e non sui due forme altre antigeniche di poliovirus.

Per dimostrare che la perdita di radioattività dal supernatante è dovuta soltanto alla affinità specifica del nanobody verso i suoi antigeni, il saggio stesso è stata eseguita con NB1, uno nanobody generato contro il regolatore trascrizionale di lrpB sulfataricus Sulfolobus e noto per avere alcuna interazione con poliovirus qualsiasi antigene. Il risultato di questa prova viene mostrato nella Figura 3. Tutti virus radiomarcato rimane nei supernatanti mostrano che non vi è alcuna reattivitàNB1 contro le tre forme antigeniche di poliovirus.

Riproducibilità dei risultati è stata testata ripetendo l'esperimento per un totale di otto volte per un dato nanobody (cioè, PVSP29F) in giorni diversi e da persone diverse. I risultati sono mostrati nella Figura 4. Il valore medio di radioattività percentuale nel supernatante è stato calcolato per ciascuna concentrazione nanobody ed è rappresentato in corrispondenza della sua deviazione standard.

Figura 1. Una panoramica del principio (A) e il metodo (B) del test. A. His-tag nanobodies che riconoscono specificamente un antigene poliovirus certo sarà in grado di interagire con le biglie magnetiche rivestite con cobalto e precipitare il virus marcato radioattivamente. Nanobodies B. His-tag vengono aggiunti al poliovirus radioattivo e incubate. Biglie magnetiche rivestite sono cobaltoaggiunto e separazione magnetica del antigene legato / legato viene eseguita. La radioattività del supernatante viene misurata e la quantità di antigene catturato può essere derivata.

Figura 2. Magnetic perline cattura affinità di antigeni diversi da poliovirus nanobody PVSS38C. La percentuale di radioattività trovato nel supernatante è rappresentata come una funzione della concentrazione di PVSS38C. Per 14S una concentrazione-risposta può essere trovato, che mostra l'interazione di PVSS38C con un epitopo esclusivamente presente 14S. Nessuna significativa interazione con N-, né H-antigene può essere rilevata, anche se non trascurabile-specifica cattura a concentrazioni molto elevate è notato.

Figura 3. Magnetic perline cattura affinità di antigeni diversi da poliovirus nanobody NB1 . La percentuale di radioattività trovato nel supernatante è rappresentata come una funzione della concentrazione di NB1. NB1 è noto per avere alcuna interazione con qualsiasi poliovirus-antigene o subunità. Poiché il 100% della radioattività si trova nel surnatante, nessun virus è stato non specificamente legato alla NB1. La perdita di radioattività in figura 2 è pertanto solo grazie alla specifica affinità del nanobody verso suoi antigeni.

Figura 4. La riproducibilità del dosaggio. Il valore medio di radioattività percentuale nel supernatante è rappresentata come una funzione della concentrazione di nanobody. L'esperimento è stato ripetuto otto volte in giorni diversi e da persone diverse. La deviazione standard è rappresentato come barre verticali.

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Discussione

Nel protocollo, la radioattività dell'antigene interagire con il nanobody è definita come la perdita di virus radiomarcato dal supernatante. Pertanto la quantità di radioattività precipitato (= 100 - uno%) (legato alle biglie magnetiche) può essere stimata in modo indiretto dalla radioattività nel surnatante (= uno%). D'altra parte, è anche possibile misurare la radioattività della frazione legata precipitato di antigene in modo da eluendo degli immunocomplessi dalle perline magnetiche con imidazolo 500 ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads His-Tag Isolamento e Pulldown	Invitrogen	101.03D	Particelle magnetiche
Optiphase 'HiSafe' 2	Perkin Elmer	1200 - 436	Scintillazione liquido