3-мерная литья смол и обработки изображений Мыши воротной вены или внутрипеченочных желчных протоков системы

Резюме

Метод визуализации и количественной оценки 3-мерной структуры мышь печеночной воротной вены или канал внутрипеченочных желчных описано. Эта техника литой изоляцией могут быть применены и к другим протоков или сосудистой системы и позволяет На месте Визуализации или количественного нетронутыми общения архитектуры системы.

Аннотация

В органах, правильная архитектура сосудистой и протоковой структур является необходимым для надлежащего физиологические функции, а формирование и поддержание этих структур является строго регулируется процесс. Анализ этих сложных, 3-мерные структуры в значительной степени зависела от любой 2-мерной экспертизы в разделе, или на красителях исследований инъекции. Эти методы, однако, не в состоянии обеспечить полное и количественной представленности протоков или сосудистых структур, они предназначены для выяснения. Кроме того, природа 3-мерных пластиковых отливок смолы создает постоянную снимок системы и является новым и широко полезный метод для визуализации и количественной 3-мерной структуры и сети.

Важным преимуществом системы литья смол является возможность определения нетронутыми и подключены, или общения, структура кровеносных сосудов или протоков. Структура сосудистой и герцогаТаль сети имеют решающее значение для функции органа, и этот метод имеет потенциал, чтобы помочь изучению сосудистой и протоковой сети несколькими способами. Смола литья могут быть использованы для анализа нормальной морфологии и функциональной архитектуры просвета структуру, определить развитие морфогенетических изменений, и выявить морфологические различия в архитектуре ткани между нормальным и болезненных состояний. Предыдущая работа использованы смолы литья для изучения, например, архитектурных и функциональных дефектов в желчных внутрипеченочных мыши системе воздуховодов, которые не были отражены в 2-мерном анализе структуры ^1,2, изменениями в мозге сосудистой болезни Альцгеймера мыши модель ³ , портал нарушения вены портал гипертонической и циррозом мышей ^4, шаги в развитии крыс созревания лимфатических между незрелых и взрослых легких ^5, непосредственные микрососудистых изменений в печени крыс, поджелудочной железы, почек и в ответ в химической травмы^6.

Здесь мы представляем способ создания 3-мерного литой изоляцией из мыши или протоковой сосудистой сети, с особым акцентом на воротной вены и внутрипеченочных желчных проток. Эти слепки могут быть визуализированы, сняв или размягчения тканей и затем могут быть проанализированы. Эта техника может быть применена практически к любому сосудистой или протоковой системе и будет непосредственно применимы к любому исследованию, расследовавшей развития, функции, обслуживание или повреждение 3-мерное протоков или сосудистые структуры.

протокол

1. Подготовка Канюля

1. Теплые 1-дюймовый длинный участок трубы PE10 кончиками пальцев и растянуть его так, чтобы трубка становится тонким.
   Примечание: размер судна или канал для канюлировали будет определять степень растяжения требуется. Канюля должна быть хорошо растягивается на желчных протоков бросает, но может быть только должны быть умеренно напряжены до вписываются в более крупную воротной вены.
2. Отрежьте трубки растянутую по диагонали для создания скошенных чаевых.
3. Вырезать другой край трубки, чтобы создать 5-6 дюймовый сегмент.
4. Вставьте в 32 калибра, ½ дюйма шприц для подкожных инъекций в не скошенный край трубки.

2. Подготовить шприц с PBS

1. Наполните шприц 3 мл с PBS.
2. Винт шприц на шприц с прикрепленными вытащил PE10 труб предварительно подготовленных.
3. Шприц Flick и поршень шприца толчок, чтобы PBS наполнил иглу и насосно-компрессорные инет пузырьков воздуха в шприце.
4. Поместите подготовленный шприц с PBS в шприц-держатель форму из пластилина. Этот держатель будет держать шприц устойчивой в то время как трубка вставляется в воздуховод.

3. Другие Установки

1. Взвесить 0,1 г катализатора в небольшой контейнер, например, одной из лунок 24-луночный планшет.
2. Вытяните 1 мл смолы в 3 шприца мл.
   Примечание: относительное количество катализатора и смолы может быть скорректирована, чтобы изменить время отверждения. Уменьшение количества катализатора, однако, может увеличить бросить усадки и приводят к менее желательным актеров.
   Примечание: При обращении смолы, принять меры предосторожности, чтобы избежать контакта со смолой или вдыхание паров смолы. Всегда надевайте перчатки и выполните шаги с участием смолы в хорошо проветриваемых помещениях, таких как химический вытяжной шкаф
3. Вырежьте кусок шелка 5,0 шов около 5 дюймов для использования в качестве лигатуры.

4. Подготовить мышь

1. Жертва взрослой мыши. Положите мышь на спину и открыть брюшную полость.
2. Положите мышь на рассекает сферу платформы. Поместите 15 мл коническую трубку перпендикулярно под мышью, чтобы увеличить видимость и доступность для печени.
3. Смочите ватный тампон с PBS и использовать его, чтобы перевернуть вверх печени и от вас, чтобы открыть вид сверху печени наряду с вены внепеченочных портала или общего желчного протока.
4. Для приведения портала вен можно предотвратить свертывание крови с помощью промывки вены при комнатной температуре PBS. Прикрепить иглы 3 мл шприц с PBS и вставить иглу в вену внепеченочных портала как можно дальше от печени, как вы можете. Аккуратно PBS через в воротной вене. Сделать ник в общей кардинальной вены для слива крови. Используйте мокрый ватный тампон, чтобы массаж печени, повышение кровь дренаж. Этот шаг не рекомендуется для желчных протоков и не может быть необходимым для всех сосудистой системы.
   Примечание: Этот шаг также может быть перфорированнойrmed 4% параформальдегидом вместо PBS. Использование 4% параформальдегида может увеличить сосудистой целостности и в результате более точных броска, в частности меньшей сосудистых структур.

5. Иглу Внепеченочные воротной вены или общего желчного протока

1. Использование изогнутых щипцов пройти хирургические шовные лигатуры под воротной вены или желчных протоков, примерно ¼ дюйма от печени.
2. Привяжите нить в свободную общих узлов. Не затягивайте этот узел.
3. Если вы работаете с открытой системой, она может быть полезной, чтобы связать и затянуть лигатуры на другом конце системы. Если вы открыли общей кардинальной вены стечь крови из воротной вены, завязать лигатуру вокруг него, чтобы увеличить давление в воротной вене и предотвращения утечки смолы в центральную вену печени.
4. Используйте весной ножницами, чтобы сделать небольшой разрез в воротной вене или желчных протоков, примерно ¼ дюйма ниже шва узла. Этот у.е.т должны проникать не более чем на половину диаметра воротной вены или желчных протоков.
5. Используя № 5 щипцы, держа воротной вены или желчных протоков на месте разреза и вставьте скошенный конец трубки в желчный проток.
6. Нажмите кончик трубки прошлом предварительно связали лигатуры и к печени.
7. Тест для катетеризации точности путем инъекции PBS через канюлю и смотреть, чтобы увидеть, если она входит в воротной вене или желчных протоков.
8. Затянуть лигатуру провести канюли на месте.

6. Литой воротной вены или канал внутрипеченочных желчных

1. Добавить предварительно измеренных 1 мл смолы предварительно измеренных 0,1 г катализатора и тщательно перемешайте. Избегайте образования пузырьков воздуха.
2. Ничья смола-катализатор смесь обратно в шприц 3 мл. Удалите пузырьки воздуха, осторожно стряхивая шприц и изгнания пузырей.
   Примечание: для литья мелких структур, это может быть полезно использовать вакуумную камеру для удаления очень маленьких пузырьков воздуха из йСмола е и повышения качества литья. Для того чтобы учесть время, чтобы выполнить этот шаг, то это будет необходимо уменьшить катализатор / смола отношение от предложенного выше, для того, чтобы замедлить смолы отверждения.
3. Осторожно установите PBS-содержащих шприца со смолой, содержащей шприц, оставив 32-иглой прикреплены к канюлю.
4. Медленно и осторожно надавите смолы в воротной вене или желчных протоков, пока сопротивление увеличивается и печень заполнена.
5. Использование мокрых ватным тампоном нежно массировать и стимулировать печень, даже заливки.
6. Удалите канюлю от структуры и быстро подтянуть лигатуры для предотвращения утечки смолы.
7. Разрешить мыши, чтобы лежать при комнатной температуре в течение 20 мин, а смолы лечит, а затем удалить печень.
8. Продолжайте либо очистки или настаиванием печени.

7. Очистить печень для визуализации на месте

1. Исправить печени в 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° C, качалки.
2. Промыть печеньPBS в течение не менее четырех часов, качалки. На данный момент, вы можете отделить печень долях, если это необходимо.
3. Высушить в 50% метанола, а затем в 100% метаноле, по крайней мере, четыре часа каждый, раскачиваясь при комнатной температуре.
4. Очистить печень в 1:2, решение бензиловый спирт и бензил бензоат (Babb), по крайней мере, 24 часа в сутки, качалки. Дольше мыть раз могут быть необходимы. Если печень не полностью ясно после 2-3 дней, вернуться к 100% метанола в течение 24 часов и повторите Babb очистки.
5. Погрузитесь в печени Babb в чашке Петри стекла для работы с изображениями на месте.

8. Размочите ткани печени

1. Удалить печени от мыши и помещали в 50 мл коническую трубку с водой. Подождите 1 час для полного отверждения смолы. Отдельные долей печени при желании.
2. Слейте воду и двигаться печени в стеклянную бутылку. Погрузитесь в 15% КОН. Оставить на ночь при комнатной температуре. Не качаться.
3. Осторожно вылейте KOH и мыть литых в дистиллированной воде. Примечание: приведение версииУ хрупкой и должны быть обработаны с особой тщательностью. Избегайте нарушая литья при добавлении или удалении жидкости из трубки.
4. Когда литой чисто, аккуратно лежали на Kimwipe высохнуть, а затем перенести в контейнер для хранения.

9. Представитель Результаты

Успешный бросок воротной вены или желчных протоков покажет непрерывной сетью все меньше отраслей простирается от рубчика в печени периферии.

На рисунке 1 показана воротной вены брошен как визуализировать на месте после Babb очистки. Рисунок 1А показывает литой всей левой доли печени и форма и размер литья. Рис. 1б показывает крупным планом одного и того же актеров, демонстрирующих проникновение смолы в наименьшей портала ветвей вены в печень периферии.

На рисунке 2 показан портала литых вену, которая претерпела KOH маceration. Рисунок 2А показывает всю левую долю печени и рис. 2В является крупным планом мелких периферических ветвей.

Эта техника также успешно применяется для внутрипеченочных желчных протоков и опубликован с использованием как Babb очистки и KOH мацерации методы ^1,2,7.

Среди распространенных проблем неполной заливки, пузыри в смоле и переполнения в окружающие ткани или системы. Рисунок 3 показывает, как признать неполное заполнение (рис. 3А), пузыри (рис. 3А), и переполнение смолы из воротной вены в центральной вены (рис. 3В).

Все изображения, сделанные с помощью Leica MZ 16 FA стереоскоп и QImaging RETIGA 4000R камеру.

Рисунок 1. Бабб-очистили литой печеночных вен оставили доли портал. А. литой показывает иерархическую структуру ветвления простирается от рубчика в печени периферии. Литой появляется в желтый цвет в сине-тонированные доли печени. B. крупным планом показывает, что смола заполнения распространяется на небольшие филиалы в печени периферии. Смола является беловатый через очищается печень. Шкала бар = 1 мм.

Рисунок 2. Tissue-мацерированном литой изоляцией печеночных вен оставили доли портал. А. литой целой доли печени показывает, что многие филиалы различных размеров. B. крупным планом показывает мелкие ветви на периферии печени. Оперение появление мелких ветвей представляет смолы заполнения синусоидальной пространства и могут или не могут быть видны на смолу бросает и приведет к увеличению кажущейся плотности филиал если он присутствует. Смола имеет белый цвет. Шкала бар = 1 мм.

Рисунок 3. Общие проблемы со смолой отливок. А. неполное заполнение левой воротной вены доли очевидно, по некоторым или всем отраслям литой не в состоянии распространяться на печень периферии. Это литой также отображает пузыри, видно, как разрывы в непрерывном литье (стрелка). B. Благодаря близости от воротной вены и центральной ветвей вены в некоторых местах, портал смолы вены часто входят и заполнить центральную вену. Это может быть признана, когда существуют два различных прикорневых ветвей (стрелки) и два ветвящиеся структуры, которые имеют различные узоры и перекрытия. Различение между техническими ошибками и истинный морфологических изменений может быть сделано двумя способами. Во-первых, литой структуры должны быть по сравнению со структурой ожидать на основе 2-мерный анализ или другие методы. Во-вторых, важно выполнять несколько дубликатов, и, когда это возможно, дать количественную оценку структурыЮр и выполнить статистический анализ, чтобы определить воспроизводимость и если есть статистически значимые морфологические изменения внутри и между различными экспериментальными и контроля над вооружениями.

Обсуждение

Мы описали конкретные примеры того, как воротной вены и внутрипеченочных желчных протоков системы печени может быть приведен, но эта техника может быть применена практически к любой другой протоков или сосудистая система с небольшими изменениями. Предыдущие исследования продемонстр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
PE10 полиэтиленовых труб	Fisher Scientific	1417012P
5-0 хирургических черные плетеные шелковые	Roboz хирургические	SUT-15-1
Steriject 32 G х 13 мм иглы	Air-Tite	TSK3213
Весна ножницы	Средства изобразительных наук	15000-08
Номер 5 щипцы	Средства изобразительных наук	91150-20
Mercox II комплекте	Лэдд исследований	21247
Бензиловый спирт	Fisher Scientific	1816-04	Oолько необходимых для Бабб-клиринговой
Бензилбензоат	MP Biomedicals, ООО	154839	Требуется только для Бабб-клиринговой
Фосфат-буферный раствор (PBS)
Моделирование глины
Шкала
Лаборатория ножницы
15 мл Трубы полипропиленовые крышки
4% paraformaldahyde
15% гидроксида калия (КОН)			Требуется только для мацерации
Бритва
100% метанола
3 мл шприца Luer Lock