Образцы хищничества риска, травоядным физиологический стресс и микробного разложения растительного опада

Резюме

Мы представляем методы оценки рисков как хищничество может изменить химический качества травоядных жертв, вызывая изменения в диете для удовлетворения требований повышенного стресса, и как разложение трупов из этих напряженных травоядных животных замедляется последующим разложением подстилки завода почвенных микробов.

Аннотация

Количество и качество щебня входа в почве определяет скорость разложения микробных сообществ, а также переработки темпы азота (N) и углерода (C) секвестр ^1,2. Завод помет содержит большинство детрита ^3, и так предполагается, что разложение лишь незначительно повлияли на биомассе входов от животных, таких как травоядные и плотоядные ^4,5. Тем не менее, плотоядные животные могут влиять микробного разложения растительного опада через цепочку взаимодействий, в которых риск хищничества изменяет физиологию их травоядных добычу, которая в свою очередь изменяет функционирование микробных почвы, когда травоядные туши разлагаются ^6. Физиологическая реакция на стресс от травоядных к риску хищничества может изменить C: N элементного состава биомассы травоядных ^7,8,9, потому что стресс от хищничества риск увеличивается травоядных базальных потребностей в энергии, что в питательными веществами ограниченного травоядных системы силс переложить их потребление с N-богатые ресурсы для поддержки роста и размножения С богатыми ресурсами углеводов, чтобы поддерживать повышенный метаболизм ^6. Травоядные животные имеют ограниченные возможности для хранения избыточных питательных веществ, поэтому травоядные животные выделяют подчеркнул N так как они увеличивают углеводно-C потребление ^7. В конечном счете, охотятся подчеркнул хищничества риска увеличения их тела C: N соотношение ^7,10, что делает их более низкого качества ресурсов для бассейна почвенных микробных вероятно, из-за снижения доступности лабильной N для микробных ферментов производства ^6. Таким образом, разложение трупов напряженно травоядных животных имеет грунтовки влияние на функционирование микробных сообществ, что снижает последующие способности микроорганизмов для разложения растительного опада ^6,10,11.

Мы представляем методологию для оценки взаимосвязи между риском хищничества и подстилки разложению почвенными микробами. Мы опишем, как: вызвать стресс у травоядных животных с хищниками риска; измерениеуверен, что те ответные реакции на стресс, и измерить последствия микробного разложения. Мы используем выводы из модели экосистемы пастбищ содержащие охоты пауков хищника (Pisuarina Мира), доминирующей травоядных кузнечик (Melanoplus femurrubrum), а также различные травы и растения разнотравно ^9.

протокол

1. Выращивание Кузнечики в условиях стресса и Stress Free условия

1. Используйте 0,5 м ² круговые, закрытые мезокосмах для предотвращения эмиграции или иммиграции видов животных (рис. 1). Построить мезокосмах использованием 2,4 м длиной 1,5 м ¼ "алюминиевой сетки забора, как строительные леса. Крышка ограждения с 2,5 м длиной 1,75 м высокопроизводительного скрининга окна алюминиевые сложенными на верхней и нижней части ограждения и скреплены вместе раза. Присоединиться к фехтованию концы образуют замкнутый круг, а затем основных перекрытия окна скрининга вместе, чтобы создать уплотнение. Установить мезокосма в почву в поле копать в 10 см глубиной на 4 см в ширину траншеи вокруг основания mesocosom, тонут в мезокосма траншею, а затем утрамбуйте дерново из траншеи вокруг затонувшей части мезокосма. сшивания круговой части окна скрининга в начало мезокосма.
2. Массив мезокосмах в реплицируемой парных экспериментальных назнп в этой области. Участок мест должны быть выбраны в соответствии с идентичности видов растений и растительного покрова относительная. Раковина клетки 10 см в землю на участке сайте.
3. Использование развертки сеть, собирать рано ^(2-й) возраста кузнечик нимфы и запасти их в мезокосмах при естественной плотности поля.
4. Использование развертки чистые, захват лиц доминирующим сит-энд-ждать охоты (не веб-ткачество) паука хищников. Клей закрыл пауков хелицеры (ротовые использовать подчинить добычу) с быстрой сушки цемента отделить риск эффекты от фактического выбор в пользу выживания отдельных кузнечиков с лучшими способностями, чтобы избежать паук хищников. Запаситесь пауков на поле плотности одного мезокосма каждой пары. Это будет стресс лечение. Мезокосмах без пауков будет стресс бесплатное лечение.
5. Разрешить кузнечик нимфы разработать до конца ^(4-й и ^5-й) возраста этапов. Соберите все люди из клетки и раndomly назначить лиц от каждой клетке в одном из трех последующих групп анализа: (1) проверка физиологическое состояние стресса; (2) проверки сдвиг в стехиометрии тела элементарный; (3) микробного разложения.

2. Проверка Grasshopper напряженного состояния

1. Измерьте кузнечик стандартной скорости обмена веществ (SMR), а скорость выбросов двуокиси углерода ( ) В incurrent проточные системы с респирометрии скорости воздушного потока 200 мл / мин. Удалить водяного пара путем пропускания потока воздуха через осушитель.
2. После лишение пищи на 16 часа (вода должна быть доступна), вес отдельных кузнечиков (± 0,1 мг), и разместить их в прозрачный 50 мл (9,2 см L х 2,0 см D) респирометре камер и дать им возможность оправиться от обработки по крайней мере, за 10 мин до начала измерений.
3. При постоянной средней температуры окружающей среды температура (температура ± 1% стандартное отклонение ошибки) в респирометре камеры, анализировать respired воздуха с помощью инфракрасного анализатора CO ₂ (например, Кубит S151-1 промилле разрешение). Измерение средней минимальной стационарного в течение 10 мин.
4. Анализатор обеспечивает дробное концентрации СО ₂ (частей на миллион), но SMR следует сообщать как скорость, так что надо превращается записи в качестве = FR _я ( - ) / {1 - [1 - (1/RQ)]}, гдеiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg "/> = incurrent дробное концентрации CO _2; = Выходящий дробное концентрации CO _2; FR = скорость потока (мл мин ^-1); RQ = дыхательный коэффициент, принимается равным 0,85 в травоядных животных.

3. Проверка сдвиг в теле Elemental Стехиометрия

1. Оцените Carbon: азота (C: N) содержание образца кузнечиков собрали с поля мезокосмах.
2. Уменьшите изменения в C: N в связи с недавними потребления продуктов питания путем удаления содержимого кишечника кузнечик под рассекает микроскопом.
3. Стоп-сухой пустой кишечник и тело в течение 48 часов, а затем растереть туша и кишечника до однородного порошка.
4. Измерьте C: N содержимого порошок, используя CNH автоматических анализаторов.

4.Микробного разложения

1. Место реплицируются пар воротники из ПВХ (15,4 см диам., Вставленный ~ 4 см в почву) в области сайта (рис. 3). Удалите всю растительность в пределах их через отсечение на поверхности почвы. Эти воротники используются для разложения меры. Кроме того, установить набор воротников ПВХ по полю сайте в качестве ¹³ C природного изобилия управления (см. ниже), в котором ни кузнечиков, ни травы-помет добавляют.
2. Для одного ошейника в каждой паре добавить 2 нетронутыми, лиофилизированный туши кузнечиков (запись биомассы добавлено) воспитал с риском хищника, как описано выше, с использованием поля-клеток. Для других воротника в каждой паре добавить 2 нетронутыми лиофилизированный туши выращивать без риска хищника.
3. Обложка ПВХ ошейники с экраном, чтобы кузнечик удаление мусорщиков из графиков, и пусть кузнечик туши разлагаться в течение 40 дней.
4. В то время как разлагающиеся туши, этикетки трава-лиель с ¹³ C.
   1. Построить четкий камеры оргстекла (60 см х 60 см х 1,5 м) с входом и выходом клапана (рис. 3В).
   2. Раковина квадратная 60 см х 60 см, деревянный каркас с резиновой прокладкой покрыта силиконовой смазкой, 5 см в землю (рис. 3В).
   3. Установите камеру на вершине деревянной раме так, чтобы камера становится печатью резиновые (рис. 3В).
   4. Подключите камеру входы для сжатых газовых баллонов, содержащих 99 атома% ¹³ CO _2. Растения внутри камеры будут помечены ¹³ C, где концентрации СО ₂ поддерживается на уровне окружающего (потому что подъемные изменяет концентрацию углерода завод разметка). Окружающие уровне поддерживаются только пульсирующие помечены CO ₂ в течение коротких периодов времени. Кроме того, камеры температура контролируется и камеры удаляются, если температура достигает 5 ° CБове окружающей среды.
   5. Через неделю после маркировки, сравните δ ¹³ С от травы-помета с природными ценностями изобилии собранные от случайной выборке идентичных видов трав использовании Thermo DELTAplus изотопной масс-спектрометр (Thermo, San Jose, CA, USA).
5. После 40 дней, добавить 10 г воздушно-сухого ¹³ С-меченого трава-помета в каждом воротнике, которые ранее были внесены поправки с тушами кузнечика.
6. Мониторинг минерализации скорость трава-помета на месте через 75 дней путем ограничения каждого воротник и отслеживания как общего дыхания почвы и дыхания ¹³ CO _2. Это достигается с помощью проточной камере техники, где газ образцы из каждой воротник мониторинг в реальном времени, в течение 8 мин каждая из которых использует полости кольцо вниз спектроскопии (CRDS; Picarro Inc, Санта-Клара, Калифорния, США; Модель: G1101 -я). CRDS позволяет одновременно отслеживать как общую и δ ¹³ Спочвенного дыхания.
7. Оценка вклада ¹³ С-меченого трава-помета в общем дыхания почвы с использованием изотопа смешивание уравнений. Количество травы-помета, полученные СО ₂ рассчитывается по следующей формуле: (. Δ ¹³ С _{дыхания} - δ ¹³ С _nat.abn) с _{травой-помета, полученных} = C _общем × / (δ ¹³ С _{травой-помета} - δ ¹³ С _{физ . ABN),} где C _{общая сумма} общая сумма C respired в течение данного измерения, δ ¹³ С _{дыхания} δ ¹³ С от respired-C для воротников изменен с мечеными траве подстилка, δ ¹³ С _nat.abn. является средним δ ¹³ С от respired C в трех природных воротники изобилие (то есть те, которые не были изменены с мусором) и δ ¹³ С _{траве помет} δ ¹³ С от травы помет добавляют к сотрудничествуllars.
8. Мониторинг и температуры и влажности почвы на эксперимент с использованием ручных зондов для коррекции различий в дыхания почвы из-за различий в температуре и влажности.
9. Несмотря на то, предназначенный для использования в полевых условиях, полости кольцо вниз спектроскопии инструмент (Picarro Inc, Санта-Клара, Калифорния, США; Модель: G1101-я) показания чувствительных к движению. Таким образом, следует поставить базовую станцию ​​измерения центральное значение для всех участков, содержащих ПВХ воротники, и подключить прибор к ошейники с длиной труб ПВХ.

Результаты

Например участок кузнечик стандартной скорости метаболизма в условиях стресса и напряжения в условиях свободного представлена ​​на рисунке 2. В связи с массой тела различия между отдельными кузнечики, и тот факт, что скорость обмена веществ меняется в зависимости от массы тела, участки должны представить уровень метаболизма в зависимости от массы тела кузнечика. Параллельные тенденции для различных методов лечения показывают, что скорость обмена веществ повышается в постоянном несколько стандартных уровень метаболизма (то есть нет массы тела х метаболического взаимодействия ставка) для всех напряженных физических лиц.

Кузнечик тела C и N элементарного содержания в риска и в условиях свободного представлены в таблице 1. Следует отметить, что существует очень небольшой (4%) разница в теле C: N соотношения между процедурами. Тем не менее, эти небольшие различия могут приводить к большим различиям в траве разложения подстилки в бассейне микробной почвы (рис. 3).

Добавление траве помет ПВХ воротники ранее поправками с напряженной или без стресса кузнечиков приводит к разной степени разложения подстилки, как это отражено в кривых, описывающих накапливаться CO ₂ выпуска из почвы за счет микробного дыхания (рис. 3). Эксперименты должны быть проверены до начала накапливаться кривые к насыщению.

	Стресс	Stress Free
Углерод (%)	48,44 ± 0,32	44,73 ± 0,46
Азот (%)	12,11 ± 0,08	11,62 ± 0,12
Carbon: Азот	4,00 ± 0,03	3,85 ± 0,04

Таблица 1. Сравнение химического состава автомобиля травоядных кузнечикcasses от условий, в которых они сталкиваются с хищниками риска (стресс) и в котором хищничества риска не было (стресса). Значения среднего ± 1 стандартная ошибка.

Рисунок 1. Иллюстрация Дизайн поля мезокосмах используемых в эксперименте и общая схема экспериментальной оценки риска воздействия на подстилке разложения.

Рисунок 2. Участка травоядных стандартной скорости обмена веществ по отношению к травоядным животным массой тела. Данные делятся на два класса в зависимости от экспериментального лечения: кузнечики из мезокосмах содержащие хищников (хищничество), чтобы вызвать стресс, и мезокосмах без хищников (контроля) и, следовательно, не индуцированной стрессом. Данные взяты из D. Halwenaи OJ Schmitz 2010, не опубликовано.

Рисунок 3. Кривых, описывающих совокупный CO _{2-релизе} микробного разложения бассейн в то время как экспериментальные траве помет входа в воротах ПВХ. Графические значения являются средними ± 1 стандартная ошибка. На графике видно, что почвы загрунтовать напряженно туши кузнечик (хищник) в результате 19% ниже (ANOVA F _1,6 = 9,06, P <0,05), Завод цены разложения подстилки, чем почвы загрунтовать стресса туши кузнечик (контроль). На вставке показан аппарат ПВХ воротник в этой области. Рисунок воспроизведен из Hawlena и др. ^6. Cick здесь, чтобы просмотреть большую фигуру .

Обсуждение

Последовательность методы, представленные здесь должно позволить систематического измерения пути стресса в виды содержащие надземных пищевые можете премьер-микробных сообществ почвы таким образом, чтобы привести к изменению последующего разложения растительного опада. Эти методы являются идеальными для изучения экосистемы состоят из членистоногих потребителей и травянистых растений нетронутыми, потому что пищевые могут быть пространственно ограничены и содержащиеся в мезокосмах.

Пространственная изменчивость может существовать за счет градиентов в фоновом режиме влажности почвы, температуры почвы, растений питательных веществ и др. Исследование дизайн позволяет массиву mescosms и ПВХ воротники, чтобы заблокировать вдоль пространственной экологические градиенты и тем самым внимание на такие экологические изменения при анализе эффектов.

Несмотря на то, предназначенный для использования в полевых условиях, полости кольцо вниз спектроскопии инструмент (Picarro Inc, Санта-Клара, Калифорния, США; Модель: G1101-я) показания себеУчитывать регистр в движении. Таким образом, следует поставить базовую станцию ​​измерения центральное значение для всех участков, содержащих ПВХ воротники, и подключить прибор к ошейники с длиной труб ПВХ.

Разложение почвы подстилки традиционно измеряется путем заключения известные количества мусора в мешки сетки из стекловолокна, хранение мешков на поверхности почвы в поле и периодически повторно измерить количественно мешки мусор скорость исчезновения (разложение). Ограничение этого метода является то, что человек не способен проследить судьбу разлагаются вещества или определить вклад в CO ₂ минерализации почвы поправки (добавлен помет) от фоновых почв CO ₂ минерализации. Метод трассирующих использованием меченых CO _2, представленные здесь помогает облегчить это материально-техническое ограничение.

Экология экосистем и биогеохимии действовали под рабочим парадигмы, потому что недоеденные завод-Помет содержит большинство детрита, подземная процессов экосистемы лишь незначительно повлияли на биомассе вклада высших трофических уровней в тканях надземной пищи, таких как травоядные себя ^6. Тем не менее, появляется все больше доказательств того, что виды высших трофических уровней экосистемы может иметь глубокое влияние на процессы подземной ^1,4,5. Метод, представленный здесь стоит для повышения количественной оценки вклада высших трофических уровней, либо непосредственно через биомассы из каркаса осаждения ^{(12, например, 13)} или выделение и выведение (например, ^{14, 15)} или косвенно, через изменение состава сообщества растений (например, ⁹ ) на экосистемы круговорот питательных веществ. Такое количественное может помочь выявить механизмы, с помощью которых животные контролировать динамику экосистем в рамках согласованных усилий по укреплению и пересмотреть текущую рабочую парадигму биотических контроль над функционированием экосистем.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагентов и оборудования	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Полость кольцо вниз спектроскоп	Picarro Inc, Санта-Клара, Калифорния, США	Модель № G1101-я
CO2 респирометре	Кубит Systems, Kingston, ON, Канада	Модель # S151
13C	Sigma-Aldrich	372382
Спектрофотометр	Thermo, Сан-Хосе Калифорния, США	Модель: Delta V Plus изотопной масс-спектрофотометр