Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Резюме

Выделение и культуре мышечных волокон является золотым стандартом В пробирке Система для изучения перехода сателлитных клеток через покоя, активации и дифференцировке. Важно отметить, что единая система сохраняет культуру мышечных волокон мышечных волокон / стволовых клеток ассоциации, которая является важным компонентом клетки ниши стволовых мышцы.

Аннотация

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved ¹. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation ^{2, 3}. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions ^3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation ⁷. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles ^{8, 9} so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium ^1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process ^1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

протокол

Все эксперименты были обработаны в соответствии с Университет Оттавы правила ухода за животными и обработке.

См. Таблицу 1 для обзора протоколов.

1. Перед началом изоляции

1. Подготовьте следующие решения:
   0,2% коллагеназы типа I в DMEM (среда Игла, модифицированной Орла; высокий уровень глюкозы, L-глютамин 110 мг / мл пирувата натрия). В течение двух EDL мышцы подготовить 2 мл 0,2% Collagenease в DMEM. Фильтр раствор через фильтр 0,22 мкм. За 10 мин до изоляции, prewarm при 37 ° С на водяной бане. Дополнительные порции неразбавленного коллагеназы могут быть заморожены при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.
   Примечание: используйте DMEM с пируват натрия во всей процедуре. Волокна не выживают в пируват натрия свободной среде.
   • Стиральные средства массовой информации (используется для выполнения всех моет). Дополнение DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина. Фильтр через 00,22 мкм фильтр перед использованием.
   • СМИ мышечных волокон культуры. Дополнение DMEM с 20% FBS, 1% куриный экстракт эмбрионов и 1% пенициллина / стрептомицина. Фильтр через 0,22 мкм фильтр перед использованием.
   • Матригель покрытием блюд. Для культуры волокна в течение длительного периода времени, мы рекомендуем использовать Matrigel в качестве покрытия подложки. Для подготовки Matrigel покрытием блюд, таять аликвоты Matrigel при 4 ° С в течение ночи. На следующий день после, разбавляют Matrigel 1:10 в DMEM. Держите Matrigel при 4 ° С во все времена и во избежание резких изменений температуры, так как это будет создавать микроскопические кристаллы в Matrigel решение в результате неравномерного покрытия. Место блюд, чтобы быть нанесен на льду. Пальто блюда с достаточным объемом, чтобы покрыть поверхность. Пусть он сидит в течение 1 мин. Полностью удалить остатки Matrigel. Пусть блюд сухие при 37 ° C в течение не менее 3 часов до использования или на ночь.
   
   Примечание: аликвоты разбавленного Matrigel могут быть повторно использованы несколько раз для покрытия цели, если хранится при 4 и де-г; C.
2. Наконец, не забудьте очистить станцию ​​микроскопа и рассечение инструментов с 70% этанола.
3. В течение двух EDL изоляции (одним кликом) подготовить пять пластиковые чашки Петри (60 * 15мм) следующим образом:
   • Четыре блюда для изоляции (1 для мышц диссоциации, 3 для последовательной промывки). Все блюда должны быть покрыты лошадиной сыворотки (HS) для предотвращения мышечных волокон от крепления на пластик. Для пальто, пипетки 3 мл лошадиной сыворотки в каждое блюдо, вихрем, чтобы позволить даже покрытие, удалите лошадиной сыворотки, и пусть блюдо сухим в течение 30 мин. Добавить 4 мл DMEM к каждому блюду. Держите блюд при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора до использования.
   
   Примечание: лошадиная сыворотка может быть использована повторно несколько раз, если хранить стерильные. Кроме того, раствор 10% УГ в DMEM может быть использован для покрытия блюд. Используйте HS покрытием блюда на протяжении всего протокола и при культивировании мышечных волокон с плавающей условиях.
   • Одно блюдо будет использоваться для культуры мышечных волокон после изоляции. Высокий звукernative размеров тарелки или форматов могут быть использованы для окончательной культуре мышечных волокон в зависимости от вниз по течению приложений. Тем не менее, мы не предлагаем блюда большего размера, чем 60 * 15 мм. Мышечных волокон могут быть сохранены в виде суспензии в течение не более чем за 96 часа до гипер сокращение происходит. Для более раза культуры, мы рекомендуем использовать Matrigel покрытием блюд или тарелок.
4. За один слой изоляции (2 EDL), подготовить две стерильные пипетки Пастера: одно большое отверстие пипетки для обработки мышц и одна небольшая пипетка отверстие для манипуляций мышечных волокон. Использование алмазов перо, чтобы сократить каждую стеклянную пипетку до нужной длины и тепла польский, чтобы сгладить края пипетки,. С помощью пламени, кривая кончик малого диаметра пипетки. Это поможет обработке одиночных волокон. Пламя для стерилизации. Пальто каждой пипетки с HS перед использованием.

2. Препарирование мышц и пищеварение

1. Для этих экспериментов, 8 недель SV129, Pax7 Creer ^Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) и Myf5-Cre; Rosa26YFP были использованы.
2. Спрей задних конечностей с 70% этанола. Pin животных (лицевой стороной вверх) для поддержки платы, чтобы иметь лучшее представление о задних конечностей во время процедуры.
3. С помощью ножниц, прорезать на всю длину конечностей и раскрыть основные мышцы. Снимите кожу, а также любые волосы или мех (рис. 1А).
4. С штрафа ножницы, разрезать через тонкую фасцию, не повреждая нижние мышцы. Визуально локализовать EDL. EDL находится в переднем отсеке задней конечности только под передней большеберцовой (TA) мышцы.
5. С помощью двух щипцов, подвергают дистального сухожилия.
6. Вырезать дистального сухожилия (как ТА и EDL) с острыми Cohann-Vannas ножницы весной.
7. С помощью щипцов удерживать обе ТП и EDL мышцы их сухожилий и деликатно вытянуть мышцы по направлению к ближнему концу. В этот момент вы должны быть в состоянии ясно видеть,EDL мышцы только под мышцу TA. Теперь, отделить EDL из мышц TA, потянув за два сухожилия в противоположных направлениях (рис. 1б). Избегайте растяжения мышц EDL при выполнении этой операции, так как это может привести к повреждению мышечных волокон.
8. Expose EDL сухожилия. Чтобы лучше представить себе проксимального сухожилия это может помочь в этот момент, чтобы удалить мышц TA. Это также может помочь, чтобы отрезать некоторые соединительной ткани вокруг колена (рис. 1С).
9. Вырезать проксимального сухожилия и аккуратно удалить EDL (рис. 1D).
10. Держа мышцы через свои сухожилия, перенести его на 2 мл предварительно подготовленный коллагеназы решение. Инкубировать при 37 ° С на водяной бане.
    Примечание: для успешного выделения волокна, важно, чтобы изолировать EDL от сухожилий, чтобы сухожилие так, чтобы целостности мышечных волокон сохраняется. Шаги 2,3 до 2,9 может быть выполнена под рассекает микроскопом. Кроме того, использование MAGNifying стекло также может помочь, чтобы иметь лучшее представление о мышцах.
11. Повторите шаги от 2,3 до 2,9, чтобы изолировать вторую EDL. Передача второго EDL в той же трубе. Чтобы избежать неравномерного пищеварение, выделение второго EDL должны быть завершены не более чем через 5 минут после первого.
    Примечание 1: инкубационный период может нуждаться в корректировке в зависимости от активности коллагеназы. Длиннее или короче инкубационный могут потребоваться в зависимости от размера, возраста и / или состояния мышц (например, фиброзно мышцы нужно больше пищеварения времени).
    Примечание 2: Если изучении спутниковых поведение клеток в условиях покоя, агитации во время переваривания мышц может активировать клетки-сателлиты ^10.
12. Во время переваривания, регулярно проверять мышцы, чтобы избежать чрезмерной пищеварения. Остановить пищеварения, когда мышцы начинают расслабляться и мышечных волокон видны. Чтобы остановить пищеварение, тщательно передавать как мышцы предварительно нагретой чашке Петри с 4 мл DMEM (dissociatiна блюде). Использование большого диаметра пипетки размера для выполнения этой операции.
    Примечание: во избежание мышцы overdigestion, так как это неизбежно приводит к изоляции гипер контракт миофибрилл.

3. Одноместный мышечных волокон Диссоциация и культуры

1. Для снятия мышечных волокон, использование большого диаметра пипетки стеклянные для промывки мышцы с теплой среде, пока волокна, естественно, начинаете были освобождены. Не растирают мышцы, так как это неизбежно приведет к разрушительным волокон. Выполнить эту и следующие шаги в рамках рассекает микроскопом.
2. Продолжать выпуск мышечных волокон, пока нужный номер будет достигнута. Если блюдо требует при комнатной температуре в течение более 10 мин позволяют 5 мин (минимум) инкубации при 37 ° C, 5% CO ₂ повторно уравновесить среды.
   Примечание: если среда достигает температуры ниже физиологического (37 ° C) в течение длительного времени мышечные волокна умрет.
3. С помощью небольшого размера отверстия пипетки, transfeГ жить одной мышечных волокон в новый нагретого блюдо (первый из трех последовательных моет). Ручка каждый мышечных волокон индивидуально, а не передача большая часть мышечных волокон все сразу. Если необходимо, инкубируют при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 10-15 мин повторно уравновесить среды.
4. Повторите шаг 3.3 для еще 2 раза или пока все мертвые мышечные волокна и мусор удаляются. Мы рекомендуем по крайней мере, три раза подряд моет для надлежащей очистки.
   Примечание: мертвым мышечных волокон будет выглядеть так коротко и гипер контракт под световым микроскопом.
5. Инкубируйте одного мышечных волокон при 37 ° C, 5% CO ₂ в последние мытья посуды (DMEM только) по крайней мере один час до перехода на питательной среде. Это позволяет мышечных волокон, чтобы приспособиться к условиям в пробирке в отсутствие сыворотки. Мы обнаружили, что непосредственной культуре мышечных волокон в сыворотке крови обогащенной среде увеличивает сжатие волокна.
6. После одного часа, передавать мышечных волокон в новый нагретого блюдо или в соответствующий формат культурыВ зависимости от вниз по течению приложений. Культура волокон в высоком сыворотки среду, которая позволяет спутникового активации клеток. Кроме того, различные концентрации сыворотки или экстракта куриных эмбрионов также может быть использован. Изменение средних каждый день.

4. Переработка приложений

1. Иммуноокрашивание. Онлайн-мышечные волокна могут быть установлены и окрашены в любой момент времени в изоляции. Иммунофлуоресценции может быть выполнена как на плавучих и субстрат-прилагаемый миофибрилл. Если окрашивание плавающей мышечных волокон, использовать небольшое отверстие пипетки стеклянные для передачи мышечных волокон от одного решения к другому. Кроме того, можно сохранить мышечные волокна в той же скважине по всей процедуре и добавить / удалить решения с помощью стеклянной пипетки. Избегайте стандартных стремление так как это приведет к удалению мышечных волокон, а также. Короче говоря, полностью удалить культурной среде; исправление мышечных волокон в предварительно нагретой 4% параформальдегида (PFA) в течение 5 мин. Широко мыть в PBS в несколько раз. ИнкубацииТе мышечных волокон в 1% глицина в PBS или других стандартных решений тушения чтобы свести к минимуму PFA фоне окрашивания. Если необходимо, permeabilize мышечных волокон с 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 10 мин, а затем на 5 минут мыть в PBS. Инкубируйте волокон в блокирующем растворе (10% лошадиной сыворотки, 0,1% Тритон Х-100, 1% NaN) в течение 1 часа при комнатной температуре или, предпочтительно, в течение ночи при 4 ° C. Альтернативные блокирования решений могут быть использованы, в зависимости от антител интерес. Мыть раз в PBS в течение 5 мин. Инкубируйте с соответствующими первичными антителами разводят в блокировании решения в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. Вымойте волокна 3 раза в 5 минут на мытье в PBS для удаления несвязанного антитела. Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами в течение 45 мин до 1 часа при комнатной температуре. Промыть 3 раза в 5 минут на мытье в PBS. Контрастирующая ядер с 1 мг / мл DAPI. Если окрашивание плавающей волокон, передавать каждое волокно стекло подходит для микроскопии. Удалите излишки ФСБ или среду. Применить монтаж медицинскойгм, а затем добавить покровное. Приступить к себе мышечных волокон под флуоресцентным микроскопом. См. Рисунок 4 для представителей иммунофлюоресценции на EDL миофибрилл. Альтернативные процедуры окрашивания использованием сильных фиксаторов описаны в Верма, М. и соавт. ¹¹ и Wosniak, AC и соавт. ^12.
2. Олигонуклеотидов или плазмиды временной трансфекции. Онлайн-мышечных волокон может быть трансфицированные плазмида или миРНК для конкретного гена / с интересом. При использовании миРНК, дважды трансфекции рекомендуется для эффективной нокдаун гена. Мы предлагаем выполнение первого трансфекции после 8 часов от изоляции. Шесть часов после трансфекции, заменить свежей средой. Для миРНК трансфекции, мы предлагаем начать с помощью конечной концентрации 50 нМ. Нокдаун экспрессии генов могут быть проанализированы путем экстракции РНК или предпочтительно иммуноокрашивания.
3. Вирусная инфекция. Заражение живых мышечных волокон можно хотя заболеваемость клеткисмерти выше, чем у олиго трансфекции и эффективность инфекции может быть переменной в зависимости от мышечной условия и возраст. Например, неповрежденные мышечные волокна мышц взрослых особенно не реагировать на вирусную инфекцию в связи с наличием базальной пластинки, которая была показана, чтобы обеспечить защитный барьер против хозяина ^{13 инфекцией, 14.} Lentiviral векторов предпочтительнее ретровирусных векторов, потому что они могут заразить покоя (не митотического) клеток. Для вирусной инфекции, желательно, чтобы культура волокон на Matrigel покрытием блюдо или тарелку, и пусть мышечных волокон приспособиться к условиям среды в течение первых 24 часов.
4. Жить Imaging. Жить изображений мышечных волокон особенно много времени и требует микроскоп с 37 ° C, 5% CO ₂ камеры. Это полезно при оценке поведения отдельных клеток спутников. Работа, проделанная с помощью этой техники сыграло важную роль для открытия спутниковых гетерогенности клеток и изучение их поведеvior на волокна (15 и 16).

Результаты

Здесь мы описали изоляции одного из мышечных волокон EDL мышцы у взрослых мышей. Успешный выход мышечных волокон зависит от нескольких факторов, таких как активность коллагеназы или мышечные условия и возраст. Самое главное, что изоляция мышцы сухожилия, чтобы сухожилия результаты в длину, нетронутыми мышечных волокон из EDL мышцы. Рисунке 1 показано шаг за шагом графическое представление "сухожилие сухожилие" изоляции. Когда мышца полностью переваривается, мышечные волокна будут освобождены, слегка надавливая на мышцы. Рисунок 2А показывает репрезентативную картину эксперимента мышечных волокон изоляции после первой стирки. На данный момент культура содержит смесь из пучков мышечных волокон одной которые выглядят как длинные и блестящие трубчатых структур, гипер контракт мышечных волокон, которые являются темными и короткими и мусора из процесса пищеварения. К концу крайней мере, три раза подряд моет, только одного живого мышечных волокон должна оставаться в ди-Ш. культуры или после анализа (рис. 2В). рис 2C показывает длинные, живые волокна по сравнению с гипер контракт волокна (C '). Во время изоляции, спутниковые клетки появляются как крошечные выступы на поверхности мышечных волокон (рис. 3А). Если поддерживается в сыворотке крови обогащенной среде, спутниковые клетки активируют, размножаться, мигрировать и в конечном итоге сливаются в мышечные трубки (B). Через 15 дней в культуре, все миотубы выразить Myf5 репортер YFP (C) предполагая, что восстановления мышц у взрослых осуществляется клеток, что в какой-то момент во время их развития выразил миогенной определяющим фактором Myf5. Все спутниковые клетки экспрессируют парных факторов транскрипции окно Pax7 ^17. Линия репортер мыши Pax7Cre-TdTomato может быть использована для отслеживания спутниковых клеток с помощью выражения TdTomato флуоресцентного сигнала (рис. 3D и E). Показано на рисунке 4 представителя иммунитетаnofluorescence двойной Pax7 + / Мед клетки спутника. Классический двойной Pax7 + / Мед + сателлитных клеток считается пролиферативная совершенного прародителями мышцы, которая будет либо завершить программу по дифференциации вниз, регулирующих Pax7 при сохранении Myod выражения или возвращение к покою путем снижения регулирующей Мед и поддержание Pax7 выражении ¹⁸

Рисунок 1. EDL изоляции мышцы задней конечности мыши. . Задних конечностей от 8 недель мыши взрослых. Стрелки указывает на дистальных (колено) сухожилия и проксимальных (пешком) сухожилия. B. Анатомическое положение передней большеберцовой (TA) мышцы и разгибателя пальцев (EDL) мышцы. C. К проведению EDL через проксимальный сухожилия, мышцы тянут в сторону колена, чтобы разоблачить дистального сухожилия. D. Дистального сухожилиявырезать и EDL будет отпущена.

Рисунок 2. Представитель результаты одного эксперимента изоляция мышечных волокон. . Яркую картину поля эксперимент мышечных волокон изоляции на первом этапе стирки. Красная стрелка указывает живых мышечных волокон, белая стрелка указывает гипер контракту мышечных волокон и желтая стрелка указывает клеток, мышечных волокон или ECM мусора. B. После последовательными промывками в DMEM, только живой мышечных волокон остается. C и C '. Изображение представляет собой длинный нетронутой живой мышечных волокон (C) и коротким гипер контракт мышечных волокон (C '). Бар 10 мкм. Фотографии были сделаны Zeiss Axio наблюдателей Z1 Микроскоп оснащен AxioCam HR.

Figur E 3. Представитель результаты одного эксперимента культуре мышечных волокон. . Яркую картину поле одной, живой мышечных волокон и связанные с ним клетки спутника (стрелка) сразу после изоляции (время 0). B. Одноместный мышечные волокна высевали на Matrigel и культивировали в сыворотке крови обогащенной среде в течение 15 дней. Белая стрелка указывает миотубы дифференцированы по сравнению с одиночными клетками (желтая стрелка) C. Одноместный мышечных волокон из Myf5Cre; RosaYFP мыши культивировали, как в B. Стрелка указывает Myf5 производных миотубы. D и E. Одноместный мышечных волокон из Pax7Cre; TdTomato были выделены и зафиксированы сразу после. Стрелки указывают Pax7 положительные покоя клетки спутника (E, красный). Ядра контрастно DAPI (D). Бар: 50 мкм. Фотографии были сделаны Zeiss Axio наблюдателей Z1 Микроскоп оснащен AxioCam HR.

способы ">
Рисунок 4. Пример иммунофлуоресцентного окрашивания сателлитных клеток на мышечные волокна. Одноместный мышечных волокон выделяют и культивируют в течение 72 часов с плавающей условиях. Спутниковое клеток на мышечные волокна были окрашены для спутникового клетки специфического маркера Pax7 (B, красный) и миогенной нормативно Myod фактор (C, зеленый). Ядра контрастно DAPI (A). Бары: 50 мкм. Фотографии были сделаны Zeiss Axio наблюдателей Z1 Микроскоп оснащен AxioCam HR.

Мышцы Dissection (5 мин каждая мышца)	Сухожилие сухожилие в изоляции Точные инструменты Минимальные повреждения мышц
Мышцы Пищеварение (30-45 мин)	Температурачувствительный Избегайте overdigestion
Волоконной изоляции	Избегайте манипуляций волокон Ликвидация мусора с нескольких стирок
Волоконно культуры (до 3-4 недель)	Формат: любой Покрытие: лошадиная сыворотка, Matrigel Medium: базально или высокой сыворотке

Таблица 1. Обзор протокола изоляции мышечных волокон. Протокол мышечных волокон изоляция состоит из 4 основных этапа. Для каждого шага, примерное время и основных критических точках обсуждается. Для детального обсуждения каждого шага, обратитесь к протоколу текста.

Обсуждение

Изоляции и культуры одного из интактных мышечных волокон мышц обеспечивает отличное в пробирке модель для изучения процесса восстановления мышц. Уникальной особенностью этой системы является сохранение сателлитных клеток в физиологической среде под базальной пластинки. Самое главное, что метод может быть использован для исследования стволовых клеток мышц поведения и покоя и активированного состояния. За последние 20 лет система мышечных волокон культура оказывала значимых идей в биологии спутниковой клеточной популяции в отношении как внутренних и внешних детерминант. По культивирования отдельных мышечных волокон, спутниковое неоднородности клетки в отношении мышечных волокон, типа мышц или регенеративный потенциал был рассмотрен ^15. Разработка исследований с использованием изображений живых одного культурного волокон позволило получить информацию о спутниковых картина миграции клеток ^16. Приобретение количественные данныеРБП возможно. Хотя много времени, он предоставляет важную информацию о распространении и возникновении определенных событий (стволовые клетки асимметричные соотношения дивизии, пролиферации и дифференцировке и т.д.). Вместе с ранее описанной приложений, белок или РНК из отдельных волокон также возможна, хотя выделения чистых населения спутниковых клеток FACS или других средств может обеспечить лучшую платформу для исследования изменений белков или экспрессии генов на молекулярном уровне. По нашему опыту, наиболее важным шагом для успешной изоляции волокна "сухожилие сухожилие« изоляции (шаги 2,5 до 2,9 в текст протокола). Это гарантирует, что после того, как мышцы пищеварения, волокна освобождаются от EDL с минимальными или без повреждений тем самым увеличивая их производительность в следующих шагах.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Реагент / Материал
Коллагеноз	Sigma-Aldrich	C0130-1G	Подготовка свежих все времена для достижения оптимального результата. Дополнительные порции неразбавленного коллагеназы может храниться при температуре -20 ° C.
DMEM с высоким содержанием глюкозы + NaPyr	Invitrogen	11995073	Добавление Pen / Strep необходимо свести к минимуму загрязнение воздуха
Характеризуется фетальную телячью сыворотку	Hyclone	SH30396.03	Лот № KUJ35152
Лошадиная сыворотка	Hyclone	SH300.74.03	Лот № AVJ82494
Экстракт куриных эмбрионов	Точная химическая	CE-650-T, Batch B7035010	Избегайте замораживания-оттаивания.
Matrigel	BD		Магазин аликвоты при -20 ° C. Избегайте замораживания-оттаивания. Хранить разбавленный аликвоты при 4 ° C.
			Оборудование
Cohann-Vannas Весна Scissor 6 мм Лезвия-Straight-Sharp	Средства изобразительных наук	15000-02
Дополнительный тонкий Iris Ножницы-10.5cm	Средства изобразительных наук	14088-10
Мория-Iris Пинцет изогнутый	Средства изобразительных наук	11373-12
Пастера Пипетки	VWR	14672-380	14672-200
Алмазный Pen	VWR	52865-005
60 * 15мм Петри	VWR	25384-092
Acrodisc 0,22 мкм	VWR	CA28-145-477
Пройдя через микроскоп StemiV6	Zeiss		Дополнительный источник света, может потребоваться, чтобы лучше сосредоточиться зрения